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简介
这是分子生物学实验技术ppt，包括了碱裂解法小量制备质粒DNA，感受态细胞制备，质粒转化，聚合酶链式反应（PCR），实验目的，实验原理，实验材料，实验方法，实验结果分析，思考题等内容，欢迎点击下载。
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一、实验目的 掌握碱裂解法提取质粒的方法 二、实验原理 分离质粒DNA方法 碱变性法 煮沸法 SDS法 羟基磷灰石层析法等 各方法分离是依据宿主菌株类型、质粒分子大小、碱基组成及结构等特点加以选择的，其中碱变性法既经济且收得率较高，提取的质粒DNA可用于酶切，连接与转化 碱变性法基本原理 在pH 12.0-12.6碱性环境中，线性的大分子量细菌染色体DNA变性，而共价闭环质粒DNA仍为自然状态 将PH调至中性并有高盐浓度存在的条件下，染色体DNA之间交联形成不溶性网状结构，大部分DNA和蛋白质在去污剂SDS的作用下形成沉淀，而质粒DNA仍为可溶状态，通过离心可除去大部分细胞碎片、染色体DNA、RNA及蛋白质，质粒DNA尚在上清中，再用酚氯仿抽提进一步纯化质粒DNA 三、实验材料 实验试剂 ＬＢ培养基： 胰化蛋白胨 10g 酵母提取物 5g 定容 1000ml pH7.5 NaCl 10g ＳＴＥ： 0.1M NaCl 10mM Tris HCl(pH8.0) 1mM EDTA ＡｍＰ 50mg/ml 溶菌酶 10mg/ml (用10mM Tris·HCl pH8.0新鲜配制） 溶液Ⅰ： 50mM 葡萄糖 25mM Tris·HCl（pH8.0） 10mM EDTA 溶液Ⅱ：（新鲜配制） 0.2N NaOH 1% SDS 溶液Ⅲ： 5M KAC 10ml 冰醋酸 11.5ml 水 28.5ml 酚，氯仿，乙醇 RNase 琼脂糖 ＴＥ： 10mM Tris-HCl(pH8.0) 1mM EDTA 四、实验方法 １．挑取琼脂培养板上的单菌落至5ml LB培养液中（含AmP 50μg/ml）， ３７℃强烈摇荡过度 ２．取1.5ml培养液至Eppendorf管中，12000g离心30秒，弃上清，用１ml STE悬浮菌体，再离心回收菌体，并重复一次，弃上清，取沉淀 ３．将细菌沉淀悬浮于100μl预冷溶液Ⅰ中，振荡混匀，冰上放置5分钟 四、实验方法 ４．加入200μl溶液Ⅱ，盖严管盖轻柔颠倒以混匀内容物，冰上放置5分钟 ５．加入150μl溶液Ⅲ，温和振荡数次，冰上放置５分钟 ６．12000g 4 ℃离心５分钟，取上清移到１个新的Eppendorf管中 ７．加入等体积酚/氯仿（１：１），振荡混匀，12000g 4 ℃离心２分钟。取上清移至另１个Eppendorf管中 ８．加入２倍体积无水乙醇，振荡混匀，于室温静置2分钟。 ９．12000g ，4 ℃离心５分钟。 10．弃上清，加入１ml 70%乙醇漂洗沉淀，盖严管盖颠倒数次，12000g 4 ℃离心２分钟。 11．弃上清，抽干乙醇，室温干燥（5-15分钟）。 12．加入50μl TE（含20μg/ml RNA 酶，不含DNA酶）溶解DNA。 13．取10μl DNA溶解液用ＴＥ稀释至1000ul测定OD260和OD280，计算OD260/OD2 80之比 14.同时以以下公式计算得率 质粒DNA得率： 稀释倍数×OD260×0.05×50/1.5ml 15．取10μl DNA溶解液加2μl Loading buffer于1%琼脂糖，电泳3小时，电压40伏。 16．电泳凝胶在透射式紫外检测仪上观察，记录结果 五、实验结果分析 １．根据质粒DNA OD260，OD280值，计算质粒DNA得率和DNA纯度 ２．记录电泳结果并说明结果内容 六、思考题 １．简要叙述溶液Ⅰ、溶液Ⅱ和溶液Ⅲ的作用，以及实验中 分别加入上述溶液后，反应体系出现的现象及其成因 ２．简要叙述酚氯仿抽提ＤＮＡ体系后出现的现象及其成因 实验二 实验目的 学习氯化钙法制备大肠杆菌感受态细胞的方法 实验原理 感受态：细菌能够吸收外源DNA的生理状态称为感受态 细菌经低渗氯化钙处理后，细胞膨胀、细胞膜的通透性发生变化，成为能容许外源DNA分子通过细胞的状态 本实验以 E.coli DH5α 菌株为受体细胞，用 CaCl2 处理受体菌使其处于为感受态 实验仪器 实验试剂 大肠杆菌DH5α LB培养基， 0.1mol/LCaCl2溶液（预冷） 实验步骤 菌株活化 感受态细胞制备 实验步骤 菌株活化 1．用接种环直接取冻存的大肠杆菌DH5α，在LB培养基平板表面划线，于37℃培养16小时 2．挑取一个单菌落，转到3－5mlLB培养基中，于37℃培养3－5小时 3．将培养液全部转到100mlLB培养基中培养2－3小时，到OD600＝0.3－0.4 感受态细胞制备 4．将培养液转入1.5ml离心管中，在冰上放置15－30min 5．6000rpm离心10min，弃上清 6．加入0.3ml预冷的0.1mol/l CaCl2，悬浮沉淀，冰上预冷10min 7．4000rpm离心5 min，弃上清 8．加入0.2ml预冷含有甘油的0.1mol/l CaCl2，悬浮沉淀，即为感受态细胞，可－70℃长期保存 实验三 实验目的 1.了解转化的概念及其在分子生物学研究中的意义 2.学习将外源质粒 DNA 转入受体菌细胞并筛选转化体的方法 转化 将外源 DNA 分子引入受体细胞，使受体细胞获得新的遗传性状的一种手段，它是微生物遗传、分子遗传、基因工程等研究的基本实验技术 常用转化方法 电击法 CaCl2、RuCl等化学试剂法 实验原理 本实验以 E.coli DH5α 菌株为受体细胞，用 CaCl2 处理受体菌使其处于为感受态，加入 pUC18质粒，在钙离子的作用下，质粒与钙离子形成复合物吸附在细菌细胞表面，经42℃短暂热刺激，细胞膜通透性增大，可吸收吸附的质粒DNA，即实现转化 实验原理 pUC18质粒携带有抗氨苄青霉素的基因，接受该质粒的受体菌具有抗氨苄青霉的特性。将转化后的受体细胞于含氨苄青霉素平板培养基上培养，只有转化体才能存活，而未受转化的受体细胞则因无抵抗氨苄青霉素的能力而死亡 影响转化率的因素 细胞生长状态和密度 转化的质粒DNA质量、浓度 试剂的质量 防止杂菌和其它外源DNA污染 实验仪器 实验试剂 感受态细胞大肠杆菌DH5α LB培养基， 0.1mol/LCaCl2溶液（预冷） 氨苄青霉素 pUC18质粒 实验步骤 1. 取目的DNA加入大肠杆菌感受态细胞中，于冰上放置30min 2. 于42℃水浴90S 3. 冰上放置2min 4. 加入1ml LB液体培养基于37℃培养1小时 实验步骤 5. 3000rpm离心2min 6. 吸出上清液0.8ml，将剩余液体轻轻吸打、混合均匀 7. 将培养液均匀涂布在含Amp+的培养基平板上 8. 将平板放置于37℃恒温培养箱中培养12-14个小时，然后观察结果 对照组 转化率 思考题 分子生物学中常用的载体有哪些 实验步骤第4步加入1ml LB液体培养基于37℃培养1小时的作用是什么 实验四 聚合酶链式反应（PCR） 实验目的 通过本实验学习PCR反应基本原理与实验技术 实验原理 聚合酶链式反应(polymerase chain reaction，PCR)，是一种在体外快速扩增特定基因或DNA序列的方法，故又称为基因的体外扩增法。 在待扩增的DNA片断两侧和与其两侧互补的两个寡核苷酸引物，经变性、退火和延伸若干个循环后，DNA扩增2n倍。 PCR技术原理 1.变性：在加热或碱性条件下可使DNA双螺旋的氢键断裂，形成单链DNA，称之为变性 2.退火：是模板与引物的复性。引物是与模板某区序列互补的一小段DNA片段 3.延伸：从结合在特定DNA模板上的引物为出发点，将四种脱氧核苷酸以碱基配对形式按5’→3’的方向沿着模板顺序合成新的DNA链 实验仪器 实验材料 1、DNA模板 2、4种dNTP 3、引物1、引物2 4、Taq酶 5、琼脂糖 6、DNA相对分子质量标准物 7、吸头、50ul PCR管 试剂 10×PCR缓冲液(含Mg2＋) 4×dNTP (每种1mmol) Tag酶 1U/ul DNA模板 引物1: 5`- GGGGAATTCATGGTGAGCAAGGGC-3` 引物2: 5`-GACCTGCAGGCATGCAAGCTTGGC-3` 引物溶液浓度 10pmol/ul 实验步骤 在0.5ml RCR管内配置20ul反应体系： PCR反应程序 (1) 94℃变性5min， (2) 94℃变性1min， (3) 52 ℃退火1min， (4) 72 ℃延伸1min。 (5) 重复(2)-(4)30次 （6）72 ℃延伸1min。 实验结果
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