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这是一个关于现代分子生物学ppt课件，主要介绍了绪论、现代分子生物学、现代分子生物学在环境科学中的应用等内容。现代分子生物学与环境科学现代分子生物学与环境科学 第一部分 绪论第二部分 现代分子生物学第三部分 现代分子生物学在环境科学中的 应用 第一部分 绪论 一. 分子生物学的定义 二. 分子生物学的发展历程 三. 分子生物学的研究内容 四. 分子生物学展望一. 分子生物学的定义 一. 分子生物学的定义 分子生物学是研究核酸、蛋白质等所有生物大分子的形态、结构特征及其重要性、规律性和相互关系的科学，是人类从分子水平上真正揭开生物世界的奥秘，由被动地适应自然界转向主动地改造和重组自然界的基础学科。一. 分子生物学的定义 二. 分子生物学的发展历程二. 分子生物学的发展历程分子生物学的发展大致可分为三个阶段。1.准备和酝酿阶段19世纪后期到20世纪50年代初，是现代分子生物学诞生的准备和酝酿阶段。在这一阶段产生了两点对生命本质的认识上的重大突破： 确定了蛋白质是生命的主要基础物质确定了生物遗传的物质基础是DNA 二. 分子生物学的发展历程 2.现代分子生物学的建立和发展阶段，欢迎点击下载现代分子生物学ppt课件哦。
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现代分子生物学与环境科学现代分子生物学与环境科学 第一部分 绪论第二部分 现代分子生物学第三部分 现代分子生物学在环境科学中的 应用 第一部分 绪论 一. 分子生物学的定义 二. 分子生物学的发展历程 三. 分子生物学的研究内容 四. 分子生物学展望一. 分子生物学的定义 一. 分子生物学的定义 分子生物学是研究核酸、蛋白质等所有生物大分子的形态、结构特征及其重要性、规律性和相互关系的科学，是人类从分子水平上真正揭开生物世界的奥秘，由被动地适应自然界转向主动地改造和重组自然界的基础学科。一. 分子生物学的定义 二. 分子生物学的发展历程二. 分子生物学的发展历程分子生物学的发展大致可分为三个阶段。 1.准备和酝酿阶段 19世纪后期到20世纪50年代初，是现代分子生物学诞生的准备和酝酿阶段。在这一阶段产生了两点对生命本质的认识上的重大突破： 确定了蛋白质是生命的主要基础物质确定了生物遗传的物质基础是DNA 二. 分子生物学的发展历程 2.现代分子生物学的建立和发展阶段 这一阶段是从50年代初到70年代初，以1953年Watson和Crick提出的DNA双螺旋结构模型作为现代分子生物学诞生的里程碑开创了分子遗传学基本理论建立和发展的黄金时代。在此期间的主要进展包括：遗传信息传递中心法则的建立对蛋白质结构与功能的进一步认识二. 分子生物学的发展历程二. 分子生物学的发展历程 3.初步认识生命本质并开始改造生命的深入发展阶段 70年代后，以基因工程技术的出现作为新的里程碑，标志着人类深入认识生命本质并能动改造生命的新时期开始。其间的重大成就包括： 1.重组DNA技术的建立和发展 2.基因组研究的发展 3.单克隆抗体及基因工程抗体的建立和发展 5.细胞信号转导机理研究成为新的前沿领域二. 分子生物学的发展历程 分子生物学的发展历程中的重大事件 1910年，德国科学家Kossel因首先分离出腺嘌呤、胸腺嘧啶和组氨酸而获得诺贝尔生理与医学奖。 1953年，美国科学家Watson和英国科学家Crick提出了DNA的反向平行双螺旋结构，并于1962年获得诺贝尔奖。这一发现标志着现代分子生物学的诞生。Crick还于1954年提出了遗传信息传递规律(即中心法则)。1958年，Meselson和Stahl做了关于DNA半保留复制的实验。二. 分子生物学的发展历程 1977 年，Sanger设计出双脱氧末端终止法DNA测序并因此荣获1980年诺贝尔化学奖。这一发明为现代分子生物学的发展提供了有力的研究手段。 1989年，美国科学家Altman和Cech因1981年发现某些RNA具有酶的功能(称为核酶)而获得诺贝尔化学奖。 1993年，美国科学家Mullis由于在1985年发明PCR (polymerase chain reaction)技术而获得诺贝尔化学奖，该技术目前已成为应用最广泛的一种生物技术。 三. 分子生物学的研究内容 1. 核酸的分子生物学核酸的分子生物学研究核酸的结构及其功能。 由于50年代以来的迅速发展，该领域已形成了比较完整的理论体系和研究技术，是目前分子生物学内容最丰富的一个领域。研究内容包括核酸/基因组的结构、遗传信息的复制、转录与翻译，核酸存储的信息修复与突变，基因表达调控和基因工程技术的发展和应用等。遗传信息传递的中心法则（centraldogma）是其理论体系的核心。三. 分子生物学的研究内容 2. 蛋白质的分子生物学蛋白质的分子生物学研究执行各种生命功能的主要大分子──蛋白质的结构与功能。尽管人类对蛋白质的研究比对核酸研究的历史要长得多，但由于其研究难度较大，与核酸分子生物学相比发展较慢。近年来虽然在认识蛋白质的结构及其与功能关系方面取得了一些进展，但是对其基本规律的认识尚缺乏突破性的进展。三. 分子生物学的研究内容 3. 细胞信号转导的分子生物学 细胞信号转导的分子生物学研究细胞内、细胞间信息传递的分子基础。构成生物体的每一个细胞的分裂与分化及其它各种功能的完成均依赖于外界环境所赋予的各种指示信号。在这些外源信号的刺激下，细胞可以将这些信号转变为一系列的生物化学变化，例如蛋白质构象的转变、蛋白质分子的磷酸化以及蛋白与蛋白相互作用的变化等，从而使其增殖、分化及分泌状态等发生改变以适应内外环境的需要。三. 分子生物学的研究内容 3. 细胞信号转导的分子生物学信号转导研究的目标是阐明这些变化的分子机理，明确每一种信号转导与传递的途径及参与该途径的所有分子的作用和调节方式以及认识各种途径间的网络控制系统。信号转导机理的研究在理论和技术方面与上述核酸及蛋白质分子有着紧密的联系，是当前分子生物学发展最迅速的领域之一。四. 分子生物学展望 从分子生物学的发展过程，可以看到在近半个世纪中它是生命科学范围发展最为迅速的一个前沿领域，推动着整个生命科学的发展。至今分子生物学仍在迅速发展中，新成果、新技术不断涌现，这也从另一方面说明分子生物学发展还处在初级阶段。分子生物学已建立的基本规律给人们认识生命的本质指出了光明的前景，但分子生物学的历史还短，积累的资料还不够。 四. 分子生物学展望 例如：在地球上千姿万态的生物携带庞大的生命信息，迄今人类所了解的只是极少的一部分，还未认识核酸、蛋白质组成生命的许多基本规律；又如即使到2005年我们已经获得人类基因组DNA3x109bp的全序列，确定了人的5-10万个基因的一级结构，但是要彻底搞清楚这些基因产物的功能、调控、基因间的相互关系和协调，要理解80%以上不为蛋白质编码的序列的作用等等，都还要经历漫长的研究道路。可以说分子生物学的发展前景光辉灿烂，道路还会艰难曲折。第二部分 现代分子生物学 一. 染色体与DNA 二. 生物信息的传递 三. 分子生物学研究法 四. 基因表达与调控 五. 疾病与人类健康 六. 基因组与人类基因组计划一. 染色体与DNA 本章主要内容: 1. 染色体概述； 2. DNA介绍。一. 染色体与DNA 1. 染色体概述 染色体位于真核细胞核的核仁内或是在原核生物的类核体上，包括DNA和蛋白质两大部分，在细胞生活周期的大部分时间内以染色质的形式存在。 单倍体真核细胞中常常有多条染色体，但是原核细胞中通常只有一条染色体，因此它们是单倍体。真核生物染色体中DNA与非组蛋白质完全融合，质量比约为1:2；原核生物染色体的蛋白质稀疏地包裹DNA。一. 染色体与DNA 一. 染色体与DNA 一. 染色体与DNA (1) 真核生物染色体 染色体的蛋白质包括组蛋白和非组蛋白。组蛋白是染色体的结构蛋白，其量大约与DNA等量，与DNA组成核小体。根据凝胶电泳性质可将其分为H1、H2A、H2B以及H3和H4，它们都富含赖氨酸和精氨酸，在进化上具有极端保守性(尤其是H3和H4)。非组蛋白大约占组蛋白总量的60%-70%，种类很多，常见的有15-20种。一. 染色体与DNA 真核生物基因组的特点 存在大量重复序列，基因组中不编码的区域多于编码区域； 功能DNA序列大多被不编码蛋白质所隔开，基因是不连续的，即“C值反常现象”。内含子、外显子 单顺反子即一个结构基因转录、翻译成一个mRNA分子，一条多肽链。 具有许多复制起点，而每个复制子的长度较小。一. 染色体与DNA 内含子：非编码蛋白的序列，因其插于外显子之间又称插入序列，居间序列。外显子：在真核生物基因中编码蛋白质的序列。单顺反子：即一个结构基因转录、翻译成一个mRNA 分子，一条多肽链。多顺反子：每分子mRNA中含几种蛋白质信息 具有许多复制起点，而每个复制子的长度较小。一. 染色体与DNA 一. 染色体与DNA 染色质是由DNA和组蛋白组成的核小体连成的念珠状结构。核小体由H2A、 H2B 、H3和H4各两个分子，一个H1分子和约 200bpDNA 组成。染色质经过多次盘绕螺旋形成压缩比为10 000倍的染色体。一. 染色体与DNA (2) 原核生物染色体 原核生物的基因组很小，一般只有一条染色体，且DNA含量少，其特点是: a.结构简练，大部分DNA都用于编码蛋白质； b.存在转录单元:功能相关的RNA和蛋白质基因往往丛集在基因组的一个或几个特定部位，形成转录单元； c.有重叠基因。 D.多顺反子mRNA 一. 染色体与DNA 2. DNA介绍 (1) DNA的结构 DNA结构包括一级结构、二级结构和高级结构。 a.一级结构:DNA分子内碱基的排列顺序，其变化 通过三联密码子引起蛋白质氨基酸顺序的改变； b.二级结构:指两条多核苷酸反向平行盘绕所生成 的双螺旋结构，分为右手螺旋和左手螺旋； c.高级结构:DNA双螺旋进一步盘绕形成的超螺旋 结构。 戊 糖核 苷核 苷 酸 DNA结构的表示法 DNA的双螺旋结构 DNA 的变性和复性一. 染色体与DNA (2) DNA的复制 a. DNA的半保留复制机理: DNA复制时碱基间的氢键断裂，双螺旋解旋并被 分开，每条链分别作为摸板合成新链，从而使新形成的两个DNA分子与原来的DNA分子碱基序列完全一致，每个子代分子的一条链来自亲代DNA，另一条链则是新合成的。 一. 染色体与DNA b. DNA复制方式: 线性DNA双链主要以复制叉方式进行，包括单一起始点的单向及双向和多个起始点的双向等多种。 环状DNA双链的复制可以分为θ型、滚环型和D- 环型几种类型。一. 染色体与DNA (3) DNA的修复大肠杆菌中的DNA修复系统二. 生物信息的传递 本章主要内容: 1. 转录: 从DNA到RNA； 2. 翻译:从mRNA到蛋白质 二. 生物信息的传递 生物信息的传递包括转录(transcription)和翻译 (translation)。二. 生物信息的传递 1. 转录: 从DNA到RNA 转录的基本过程包括:模板识别、转录起始、通过转录子以及转录的延伸和终止。 转录机器的主要参与成分: a. RNA聚合酶:如右图所示； b. 转录延伸复合物:在转录 的不同阶段组成不同。二. 生物信息的传递 转录的起始中起主要作用的是启动子，但近年科学家又发现了另一类与转录起始有关的DNA序列，并将其命名为增强子。 *启动子:指确保转录精确而有效地起始的DNA序列。 *增强子:位于转录起始点上游约200bp处的能强化转录起始的重复序列。 二. 生物信息的传递 转录的终止包括以下两类:不依赖于ρ因子的终止和依赖于ρ因子的终止。 由于不同的生理要求，在转录过程中即使出现终止信号仍需要继续转录，这就出现了抗终止现象:破坏终止位点 RNA的茎-环结构和依赖于蛋白质因子的转录抗终止。 mRNA的结构 tRNA的三叶草结构 tRNA的三级和二级结构 (三）rRNA的结构二. 生物信息的传递 2. 翻译:从mRNA到蛋白质 核糖体是蛋白质合成的主要场所，mRNA是蛋白质合成的模板，转移RNA (transfer RNA， tRNA)是模板和氨基酸之间的接合体。但有些蛋白质在合成开始不久后便转在内质网上合成。 mRNA与蛋白质的之间的联系通过遗传密码的破译来实现。 * 三联密码子:mRNA上翻译成蛋白质多肽链上的一个氨基酸对应的3个核苷酸。二. 生物信息的传递二. 生物信息的传递 tRNA在蛋白质合成中处于关键地位，既为每个三联密码子翻译成氨基酸提供了接合体，也为准确无误地将自己所需要的氨基酸运送到核糖体上提供了运送载体。 核糖体执行蛋白质的合成功能，是由几十种蛋白质和几种核糖体RNA (ribosomal RNA， rRNA)组成。二. 生物信息的传递二. 生物信息的传递三. 分子生物学研究方法本章主要内容: 1. DNA重组技术； 2. DNA操作技术； 3. 基因的分离与鉴定； 4. 基因克隆的主要载体系统。三. 分子生物学研究方法 分子生物学研究之所以在20世纪中叶开始得到高 速发展，最主要的原因之一就是现代分子生物学研究方法，尤其是基因操作和基因工程技术的进步。 基因操作主要包括DNA分子的切割与连接、核酸 分子杂交、凝胶电泳、细胞转化、核酸序列分析以及基因的人工合成、定点突变和PCR扩增等技术。 基因工程技术是核酸操作技术的一部分。三. 分子生物学研究方法 1. DNA重组技术 重组DNA的核心是用限制性核酸内切酶 (restriction endonuclease) 和DNA连接酶对DNA 分子进行体外切割与连接。三. 分子生物学研究方法 2. DNA操作技术 DNA操作技术主要包括以下技术: (1)核酸的凝胶电泳:琼脂糖凝胶电泳和聚丙烯酰胺 凝胶电泳 (2)核酸的分子杂交； (3)细菌转化； (4)核苷酸序列分析； (5)基因扩增。三. 分子生物学研究方法 (1) 核酸凝胶电泳技术 原理:根据不同核酸分子的荷电状态和分子大小在凝胶电场中的不同迁移率将其分开。根据电泳支持介质将其分为琼脂糖凝胶电泳和聚丙烯酰胺凝胶电泳；以电泳方式可将其分为水平式和垂直式。 * 双向电泳技术:目前第一向一般为等电聚集电泳(载体为两性电解质pH梯度)，第二向为梯度SDS电泳。三. 分子生物学研究方法 (2) 核酸的分子杂交 目前主要的核酸杂交技术主要包括: * DNA探针的Southern杂交； * RNA探针的Northern杂交； * 核酸原位杂交； * 基因芯片技术。 三. 分子生物学研究方法 * DNA探针的Southern杂交 DNA探针的Southern杂交的主要技术骤： a. 琼脂糖凝胶分离DNA样品； b. DNA的转膜(Southern印迹、虹吸印迹法)； c. 预杂交； d. DIG(地高辛生物素)标记的DNA探针与靶 DNA 杂交。 * RNA探针的Northern杂交 该技术与DNA探针的Southern杂交的主要步骤是一致的。 三. 分子生物学研究方法 * 核酸原位杂交 核酸原位杂交(nucleic acid hybridization in situ):以 特定标记的已知顺序核酸为探针，与细胞或组织切片中的核酸进行杂交，并对其进行检测的方法。由于特异性高，并可精确定位，因此该技术广泛应用与医学研究，并已经开始应用于环境科学研究(见第三部分)。三. 分子生物学研究方法 根据其所用探针及所要检测核酸的不同，核酸原位杂交可分为DNA/DNA、RNA/DNA和 RNA/RNA杂交。 核酸原位杂交的基本步骤:细胞的固定、预杂交、杂交、冲洗和放射自显影(或免疫酶法显色或荧光检测) 显示杂交结果。三. 分子生物学研究方法 基因芯片技术 基因芯片的工作原理与经典的核酸分子杂交一致，即应用已知核酸序列作为探针与互补的靶核苷酸序列杂交，通过随后的信号检测进行定性与定量分析。基因芯片在一微小的基片表面集成大量的分子识别探针，能够在同一时间内平行分析大量的基因，进行大信息量的筛选与检测分析。基因芯片主要技术流程包括:芯片的设计与制备；靶基因的标记；芯片杂交与杂交信号检测。 三. 分子生物学研究方法 (3) 细菌转化 细菌转化是指一种细菌菌株由于捕获了来自另一细菌菌株的DNA而导致性状特征发生遗传改变的生命过程。 (4) 核苷酸序列分析 * Sanger双脱氧链终止法； * Maxam-Gilbert化学修饰法； * DNA杂交测序法(SBH)。三. 分子生物学研究方法三. 分子生物学研究方法 (5) 基因扩增 聚合酶链反应(polymerase chain reaction， PCR) 是1983年美国PE-Cetus公司人类遗传研究室的Mullis 等发明的具有划时代意义的聚合酶链反应，最初使用的DNA聚合酶是大肠杆菌 DNA 聚合酶 I 的Klenow片段，Taq DNA多聚酶(Taq DNA polymerase)的分离使PCR技术得以广泛应用。三. 分子生物学研究方法 PCR技术是当今分子生物学领域种类最多、发展最快、应用最为广泛的技术之一，现在已经有多达20种常用的PCR技术，而且随着研究的深入，还将不断有新的PCR方法出现。在所有的PCR方法中，引物的设计始终是其关键。引物设计的好坏决定了反应的特异性和扩增的效率，因此，引物设计一般采用商业化软件进行，根据已有的核酸序列数据库进行筛选。 三. 分子生物学研究方法三. 分子生物学研究方法 3. 基因的分离与鉴定 基因的分离和鉴定实际上就是我们通常所说的基因克隆的两个主要内容，包括以下四个基本步骤: (1)用于基因克隆的DNA材料的选择以及DNA子 的片段化； (2)外源DNA片段与载体分子的体外连接反应； (3)人工重组的DNA分子导入它们能进行正常复制 的宿主细胞； (4)重组体分子的转化子克隆的选择或筛选。三. 分子生物学研究方法 4. 基因克隆的主要载体系统 (1)质粒(plasmid) DNA载体系统； (2)λ噬菌体载体系统； (3)柯斯质粒(cosmid)载体系统； (4)真核生物载体系统。 四. 基因表达与调控 本章主要内容: 1. 原核基因表达的调控； 2. 真核基因表达的调控。 四. 基因表达与调控 1. 原核基因表达的调控 基因表达调控主要表现在两个方面: * 转录水平上的调控(transcriptional regulation)； * 转录后水平上的调控(post-transcriptional regu – lation)，包括mRNA加工成熟水平上的调控(dif – ferential processing of RNA transcript)和翻译水 平上的调控(differential translation of mRNA)。 四. 基因表达与调控 原核生物的基因调控主要发生在转录水平上，因为这种调控方式对原核生物是最经济的，可以减少其物质和能量的损失。 根据调控机制的不同将其分为两类: * 负转录调控(negative transcription regulation):调节物是阻遏蛋白(repressor)，阻止结构蛋白的转录； * 正转录调控(positive trans transcription regulation):调节物是激活蛋白(activator)，同时需要效应物分子存在。 四. 基因表达与调控原核生物基因中的调节模型－操纵子 操纵子学说由法国巴斯德研究所的Jacob和Monod 于1961年提出。 原核生物中的多种操纵子: * 乳糖(lac)操纵子； * 色氨酸(trp)操纵子； * 半乳糖(gal)操纵子； * 阿拉伯糖(ara)操纵子。 四. 基因表达与调控 四. 基因表达与调控 2. 真核基因表达的调控 真核生物基因调控可分为两大类:第一类是瞬时调控或称可逆性调控，包括某种底物或激素水平升降时，或细胞周期不同阶段中酶活性的调节；第二类是发育调控或称不可逆调控，是真核基因调控的精髓部分。 五. 疾病与人类健康 现代科学认为人类疾病都是由基因引起的，根据这一点，将人类疾病可以分为3大类: * 经典单基因病:主要病因是某个基因位点上产生 了缺陷等位基因； * 多基因病:涉及多个基因及调控基因表达的环境 因子之间的相互作用； * 获得性基因病:主要由病原微生物感染引起的传 染病。 六. 基因组与人类基因组计划 基因组(Genome)是1924年提出用于描述生物的全部基因和染色体组成的概念。1986年由美国科学家Thomas Roderick提出的基因组学(Genomics)是指对所有基因进行基因组作图(包括遗传图谱、物理图谱、转录本图谱)，核苷酸序列分析，基因定位和基因功能分析的一门科学。自从1990年人类基因组计划实施以来，基因组学发生了翻天覆地的变化，已发展成了一门生命科学的前沿和热点领域。 六. 基因组与人类基因组计划人类基因组计划 人类基因组计划是美国科学家于1985年率先提出的，旨在阐明人类基因组30亿个碱基对的序列，发现所有人类基因并搞清其在染色体上的位置，破译人类全部遗传信息，使人类第一次在分子水平上全面地认识自我。计划于1990年正式启动，这一价值30亿美元的计划的目标是，为30亿个碱基对构成的人类基因组精确测序，从而最终弄清楚每种基因制造的蛋白质及其作用。 第三部分 现代分子生物学技术在 环境科学中的应用 本章主要内容: 1. 基因工程技术在环境科学中的应用 2. 其他分子生物学技术的应用 第三部分 现代分子生物学技术在 环境科学中的应用 现代分子生物学的迅速发展，也促使了该技术在环境科学中的应用。目前，现代分子生物学技术在环境科学领域的应用主要是应用基因工程技术培育高效微生物菌株(超级细菌)。此外，还有利用其他分子生物学实验技术(如核酸分子杂交技术、生物芯片技术)进行污染处理系统的生物 (主要是微生物)群落分析，从而改进处理工艺和筛选生物品种。第三部分 现代分子生物学技术在 环境科学中的应用 1. 基因工程技术在环境科学中的应用 基因工程在环境污染生物处理中有着广泛的应用，主要体现在以下几个方面: (1)难降解有机化工物质的高效降解基因工程菌； (2)抗金属的基因工程菌； (3)农药类物质的降解基因工程菌和生物农药菌株 的筛选； (4)重金属高富集植物的研究。 “Fishing” for microbes 环境微生物基因组学和蛋白质组学的研究 生物强化技术由利用基因工程菌向土著细菌的筛选和优化过渡 生物强化技术与传统技术相结合已成为一个发展方向 分子生物技术的发展支持强化技术的发展 生物强化技术效果的微观观察生物强化技术和基因工程菌实际应用需解决的技术难题 ⊙水中成分复杂，基因工程菌或投加菌效率较低； ⊙水中底物浓度太低，不足以维持基因工程菌的生长； ⊙基因工程菌或投加菌不如土著菌种竞争能力强； ⊙系统中原生动物对基因工程菌或投加菌的捕食； ⊙基因工程菌或投加菌优先利用其他底质，对目标物作用慢； ⊙水中的抑制性基质抑制基因工程菌或投加菌的生长和代谢。微生物的新型调控手段分子水平上的化学分析 原子级显微镜 微电极质谱核磁生物芯片化学芯片 分子水平上的生物学分析 PCR 聚合酶链反应 DGGE 凝胶电泳 FISH 荧光原位杂交 LSCM 激光共聚焦显微镜 第三部分 现代分子生物学技术在 环境科学中的应用 2. 其他分子生物学技术的应用 (1)聚合酶链反应（PCR）； (2)核酸分子杂交技术； (3)电泳技术； (4)基因芯片技术： (5)rRNA基因序列同源性分析技术； (6)DNA测序技术；第三部分 现代分子生物学技术在 环境科学中的应用 (1) 聚合酶链反应（PCR） 聚合酶链反应（PCR）是一种体外扩增核酸序列从而得到多个核酸拷贝的技术。 除了原位PCR，一般在进行PCR前都要进行核酸的提取与纯化，对从环境中获得的样品进行PCR扩增后，一般还要联合其他技术如电泳技术对产物进行分析，或进行多态性分析。 第三部分 现代分子生物学技术在 环境科学中的应用 * PCR-电泳技术的联合使用 对环境样品进行PCR扩增后，其产物还需要进行分析，现在有很多研究者利用电泳技术对其进行分析，如PCR-TGGE，PCR-DGGE。Juck D等对从加拿大北部两省被石油烃污染的土壤中提取的总DNA中的 16S rDNA片段经PCR扩增后进行DGGE，分析受到污染的土壤微生物群落多样性在污染前后的变化情况。 第三部分 现代分子生物学技术在 环境科学中的应用 * PCR扩增产物的多态性分析 对PCR产物进行多态性分析可以利用随机扩增多态性DNA(RAPD)、限制性片段长度多态性(RFLP)和单链构象多态性(SSCP)等多态性分析技术。 Erb等人利用PCR扩增从被PCB污染的沉降物中提取的总DNA中的bphC基因，对PCB的bph降解途径中的bph基因进行研究，观察到了bphC基因的限制性多态，表明该沉降物中降解PCB的微生物群落具有生物多样性。第三部分 现代分子生物学技术在 环境科学中的应用 PCR-RAPD分析可以用来探测含有混合微生物种群的各种生物反应器中的微生物多样性。用RAPD分析所得到的基因组指纹图谱在比较一段时间内微生物种群的变化及比较小试规模和中试规模的反应器方面是很有价值的，但是尚不足以用于估测群落的生物多样性。有人用RAPD分析检测实验室规模的油性淤泥培养料中的细菌菌群发现，用添加油脂淤泥的培养料更适合于不同的微生物种群生长。第三部分 现代分子生物学技术在 环境科学中的应用 (2) 核酸分子杂交技术 核酸分子杂交技术主要是使用核酸探针对污染处理系统的微生物群落进行生物多样性和生态功能的研究，在基因水平上评价种群的遗传分化，并在分子水平上阐述分子适应等生态问题的机制，更好地揭示生物与环境之间的生态学意义，为污染治理提供理论依据。目前在环境科学研究中应用较多的核酸杂交技术是荧光原位杂交(fluorescence in situ hybridization ， FISH)，此外也有使用放射性标记探针的核酸杂交。第三部分 现代分子生物学技术在 环境科学中的应用 *荧光原位杂交(FISH) 荧光原位杂交是一种利用非放射性的荧光信号对原位杂交样本进行检测的技术。它将荧光信号的高灵敏度、安全性，荧光信号的直观性和原位杂交的高准确性结合起来，通过荧光标记的DNA探针与待测样本的DNA进行原位杂交，或结合定量PCR(quantitative PCR)，在荧光显微镜下对荧光信号进行辨别和计数，从而对样本中的微生物进行定性或定量的分析。第三部分 现代分子生物学技术在 环境科学中的应用 1989年DeLong首次使用了荧光标记的寡核苷酸探针检测单个微生物细胞。FISH技术通过激发在细胞内与特异的互补核苷酸序列杂交的寡核苷酸探针上的荧光标记物发射荧光来检测细胞内核酸序列的特异性，从而为分析该细胞的种属特性提供依据，主要步骤包括样品固定、样品预处理、预杂交、探针和样品变性、杂交、漂洗和检测杂交信号。Amann和Snaidr根据PCR扩增的rRNA序列设计寡核苷酸探针，用FISH 技术诊断了活性污泥中的微生物群落结构。 第三部分 现代分子生物学技术在 环境科学中的应用第三部分 现代分子生物学技术在 环境科学中的应用 (3) 电泳技术 电泳技术是分离和纯化核酸的常用技术。一般根据凝胶材料的不同分为琼脂糖凝胶电泳和聚丙烯酰胺凝胶电泳，前者由于在分离范围较广，主要用于分析大片段核酸，分离大小在0.2kb~50kb范围内的核酸片段；后者由于分离度较好，主要用于分离小片段核酸。第三部分 现代分子生物学技术在 环境科学中的应用 除了应用于常规核酸分离的电泳技术以外，在环境科学中应用较多的电泳技术还包括变性梯度凝胶电泳(denaturing gradient gel electrophoresis ， DGGE)温度梯度凝胶电泳(temperature gradient gel electrophoresis，TGGE)和单细胞凝胶电泳(single cell gel electrophoresis，SCGE)。 第三部分 现代分子生物学技术在 环境科学中的应用 * DGGE DGGE的原理是使用一对特异性引物扩增从污染生物处理系统提取的DNA或RNA，得到长度相同但序列有异的产物，然后在添加了线性梯度变性剂的6%聚丙烯酰胺凝胶上电泳分离。由于同一温度下在同一浓度变性剂的凝胶中，序列不同的核酸片段部分解链程度不同，从而影响其电泳迁移率，就实现了不同的核酸片段在凝胶上分离形成不同的条带，然后进行分析。第三部分 现代分子生物学技术在 环境科学中的应用 1993年Myuzer首先将DGGE技术应用于分子微生物生态学研究，以确定自然环境中微生物群落的遗传多样性。Logemann等在研究高效脱氨氮系统SHARON 的微生物群落时，利用DGGE对经PCR扩增后的16S rRNA产物进行分析，表明在SHARON中至少存在四种不同类型的细菌，此外，在与16Sr RNA基因文库进行对比分析后发现优势菌落(69 %)与Nitrosomonas eutropha有很大的相似度(98.8 %)。 第三部分 现代分子生物学技术在 环境科学中的应用 * TGGE TGGE的原理与DGGE类似，除利用核酸分子的大小和带电荷数的多少外，还利用了核酸分子的分子构象。稳定的构象由氢键和范德华力共同维系，并受环境温度、盐离子浓度、pH值等影响，如果环境温度升高到某一限定点就可破坏氢键和范德华力，这时分子即处于变性状态，此过程就称热变性，TGGE就是利用不同构象的分子具有不同的变性温度来进行分离。 第三部分 现代分子生物学技术在 环境科学中的应用 相比于DGGE技术在环境科学领域的应用，TGGE 技术目前的应用范围要小得多，但国内已有人如高平平等利用TGGE对焦化废水处理系统活性污泥细菌种群的动态变化和多样性进行了研究，在8个监测时期中同一曝气池活性污泥的16S rDNA V3-PCR TGGE指纹图谱基本一致图谱间的相似性系数。 第三部分 现代分子生物学技术在 环境科学中的应用 (4) 基因芯片技术 基因芯片是将大量靶基因（或基因片段）有序地、高密度地点在玻璃片或硅片或塑料片上等载体上所形成的矩阵，将待侧样品用荧光染料标记制备成探针与芯片杂交，杂交信号用激光扫描仪检测，计算机分析检测结果，可获得类似与传统的点杂交的杂交数据，以达到快速、高效、高通量及平行性的分析生物信息的目的。第三部分 现代分子生物学技术在 环境科学中的应用 在环境微生物学研究中，基因芯片具有一次试验就可以筛选饮用给水中几百病原体的潜在能力。 尽管基因芯片技术具有很大的潜力，但是目前在环境科学中的应用却比较少，一方面由于基因芯片本身的技术还有待完善，另一方面也由于基因芯片技术目前尚比较昂贵，一般的实验室难以开展这方面的研究。第三部分 现代分子生物学技术在 环境科学中的应用 (5) rRNA基因序列同源性分析技术 rRNA基因序列同源性分析技术是综合运用多项分子生物学技术对微生物中的rRNA基因进行分析，从而对微生物多样性进行分析的技术。这是微生物分子生态学中最重要的方法，取得的成果也最多。第三部分 现代分子生物学技术在 环境科学中的应用 rRNA基因序列同源性分析技术中所使用的技术主要包括环境微生物样品总DNA的提取、引物与探针的设计、PCR扩增、遗传指纹技术(主要指梯度凝胶电泳技术，包括变性梯度凝胶电泳DGGE和温度梯度凝胶电泳TGGE)、基因克隆文库的构建、序列测定、序列分析与系统树构建、核酸杂交(目前应用比较多的是荧光原位杂交技术)等。实际的研究与应用中，我们可以根据研究对象和研究目的的不同单独或组合使用以上技术。第三部分 现代分子生物学技术在 环境科学中的应用 (6) DNA测序技术 DNA测序是区分个体间遗传差异及揭示DNA多样性的终极方法。随着自动测序仪的普遍使用，大量的模式生物基因库已经构建成功，为研究功能基因以及基因组计划的顺利实施奠定了良好的基础，但若对相似生物基因组进行测序将会白白浪费许多的时间和资金，因此该方法在环境科学中一般仅限于基因组特殊区域或特异基因（例如特定污染物的降解基因）。
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