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简介
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第三章 转基因动物技术与药物生产 特点: 基因体外重组 不受生物种类的限制 精确细致地控制 质粒载体 质粒是细菌染色体外小型双链环状DNA复制子，对细菌的某些代谢活动和抗药性表型有一定作用。质粒DNA不但能在细菌中复制，并且在添加真核复制信号和启动子后，可以构建出能在原核或真核细胞中均可复制的穿梭质粒，因此以质粒为载体的基因克隆方法被广泛使用。 染色体DNA的三种功能元件（functional elements） 自主复制DNA序列(autonomously replicating DNA sequence， ARS) 着丝粒DNA序列(centromere DNA sequence，CEN) 端粒DNA序列(telomere DNA sequence，TEL) 优点： A. 保证大片段DNA的完整性 B. 提高较长外源片段在动物转基因时的整合率 C. 保证目的基因上下游的侧翼序列的完整性 因而可以消除或减弱基因整合后的位置效应。 YAC介导法制备转基因动物具有广阔的应用前景。 DEAE-葡聚糖法 磷酸钙-DNA共沉淀法 脂质体载体包埋法 腺病毒载体 运载DNA片段较大 安全性好 宿主范围广 对受体细胞分裂周期要求不严 外源基因表达高效 反转录病毒载体 可获得稳定有效的转染 可用于不易转化的细胞 但有免疫反应，转染能力有限 DNA构型和末端结构： 线状与环状DNA均可用于转基因研究。 线状DNA的末端结构差异(平末端、粘性末端)对整合效率与整合分子的结构影响不大。转移的DNA在染色体上的整合大多呈首尾相连的多拷贝，不同构型与末端间无明显差异。 载体： 原核克隆载体(如质粒)序列不影响携带基因的整合效率，但影响基因在转基因动物中的表达。注射前去除载体的基因，其表达水平显著高于保留载体的基因，且前者具有较好的重复性。对某些基因(如珠蛋白基因)，只有注射前去除载体才能得到组织特异性表达。 留在核内的DNA溶液体积不明。 DNA浓度易掌握，1ug/ml-3ug/ml 溶解DNA的缓冲液： 一般含5-10mmol/ml Tris(pH7.4)与0.1-0.25mmol/L EDTA EDTA浓度需适中 卵供体母鼠： 超排卵供体——4～6周鼠 3—4周母鼠产卵更多但卵细胞膜脆性较大，在处理过程中易破裂。 5周以后母鼠产卵逐渐减少。超排卵较好的母鼠每只每次产20—30个卵。 公鼠 性成熟约在6—8周，不同种系公鼠性维持时间不一，一般1—2年，但纯系公鼠只可使用8—10个月。每个公鼠需单笼饲养以免咬伤，饲养于2周后方可与超排卵母鼠交配。每个母鼠与1个公鼠交配，次日上午检查精栓，如两次以上都不能使母鼠有精栓，则需更换公鼠。为保证有足够的受精卵，公鼠最好每周只交配1次。 假孕母鼠 母鼠在正常发情期与结扎公鼠交配即产生，假孕母鼠作为显微注射后受精卵的受体及其后的养母。这种母鼠在6周至5个月较适宜，体重最好大于20克，已产过仔并成功抚育过仔鼠的假孕母鼠最理想。 受精技术 人工授精 壶腹部手术授精 体外授精 其他方法 原始生殖细胞技术 体细胞核移植技术 逆转录病毒载体注射MⅡ期的卵母细胞 精子头与外源DNA合并注射卵母细胞 快速生长与肉质改良 增强抗病性 增加羊毛产量和性能 抗冻品种培育 研究病毒性疾病 研究建立人类疾病的转基因动物模型 转基因动物与基因治疗 生产天然活性药物蛋白 在异种器官移植中的应用 转基因动物应用面临的问题 目的基因整合与表达的效率较低，或者引起宿主细胞基因突变。 转基因动物的负面效应。 研究费用高，需要相当的财力支持 动物乳腺生物反应器的制备 表达载体的构建 目的基因的选择 体外重组 基因转导 胚胎移植 鉴定 动物乳腺生物反应器的应用 改良乳汁品质 药用蛋白 动物乳腺生物反应器的优点 产品质量稳定 产品成本低 研制开发周期短 无污染 经济效益显著 动物乳腺生物反应器存在的问题 外源基因在动物体内的位点整合问题 乳蛋白基因表达组织特异性问题、 目的蛋白的翻译后修饰问题 转基因表达产物的分离和纯化问题 转基因的技术与方法问题 伦理道德问题
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