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简介
这是基因工程育种ppt，包括了基因工程育种，目的基因的制取，目的基因的概念，目的基因的制取的方法，直接分离法，反转录法，聚合酶链式反应（PCR) ，酵母菌载体，黏性末端连接，人工接头连接，电转化过程，超声波介导转化法，总结等内容，欢迎点击下载。
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基因工程育种 基因工程育种包括所有利用DNA重组技术 将外源基因导入到微生物细胞，使后者获得 前者的某些优良性状或者利用后者作为表达 场所来生产目的产物。 目的基因的制取 限制性内切酶 一类能识别双链DNA分子特异核苷酸序列的DNA水解酶。 它是体外剪切基因片段的重要工具，广泛应用于基因片段的体外切割重组、转化菌重组子的筛选。 分类：限制性内切酶I、限制性内切酶II、限制性内切酶III 每一种限制酶，都有自己特定的作用位点 “鸟枪法”的一般步骤 （散弹法） PCR的基本原理 PCR反应条件 PCR过程 PCR的特点 PCR的基本原理 PCR反应条件 PCR过程 PCR的特点 PCR的基本原理 PCR反应条件 PCR过程 PCR的特点 PCR的基本原理 PCR反应条件 PCR过程 PCR的特点 PCR的基本原理 PCR反应条件 PCR过程 PCR的特点 载体的选择构建与体外重组 载体的选择构建与体外重组 载体 载体： 在基因工程操作中，常常把外源DNA片段利用运载工具送入生物细胞，我们把携带外源基因进入受体细胞的这种工具叫做载体。 理想载体必须具备的条件： 1.具有自主复制能力； 2.具有多个限制性内切酶的切点，且切点是单一的，这样可将多个外源DNA片段插入其中； 3.具有一个或多个选择性遗传标记； 4.载体DNA的分子量适当，可容纳较大的外源DNA片段，又可在受体细胞内扩增较多的拷贝； 5.在细胞内稳定性高，这样可以使重组体可以稳定传代而不易丢失。 载体分类： 来源：质粒载体、噬菌体载体、病毒载体； 性质：温度敏感型载体、融合型表达载体、非融合型表达载体； 受体细胞：原核细胞载体、真核细胞载体 用途：克隆载体、表达载体； 原核细胞载体：细菌质粒 、噬菌体、噬菌粒、科斯质粒 真核细胞中的载体 病毒类（杆状病毒、SV40、逆转录病毒等） 非病毒类（酵母菌载体、穿梭质粒、Ti质粒等） 质粒载体 细菌质粒 (plasmid) 载体是基因工程中最常用的载体， 它必须包括三种组成部分： 1 复制必须区 2 选择标记基因 3 限制性核酸内切酶的酶切位点（克隆位点，MCS) 常用质粒载体 1. pSC101 2. pBR322 组成： 来自pSC101的四环素抗性基因Tetr 来自ColEl的衍生物pMBl的松弛复制起点ori 来自RSF2124的氨苄青霉素抗性基因Ampr。 特点： 1 具有多个单一的限制性内切酶位点。 2 Tetr中有BamH1切点（G↓GATCC）和SalⅠ切点（G↓AATTC），Ampr中有PstⅠ切点（CTGCA↓G）。 3 利用ColEl的复制子，所以在细胞中是多拷贝的，可通过氯霉素使质粒拷贝数进一步扩增。 3.pUC系列质粒载体 特点： 1 具有更小的分子量（2686bp）和更高的拷贝数。 2 具有多克隆位点 噬菌体载体 （一）λ噬菌体载体 1.特点： λ噬菌体颗粒中DNA为线状双链DNA分子，全长48502bp，两端各有一段长度为12个核苷酸的互补单链（粘端），称为cos位点。 λ噬菌体有61个基因，其中有1/3的区域是其裂解性生长的非必需区，这一区段的缺失，或在此区段中插入外源DNA，并不影响噬菌体的增殖，这就是λ噬菌体可作为基因载体的依据 。 2.λ噬菌体的缺陷与改造 λ噬菌体的缺陷： ⑴ 基因组太大（49kb）； ⑵ 酶切点太多，它有5个BamH1位点（G↓GATCC），6个BgⅠ位点（A↓GATCT），5个EcoRⅠ位点（G↓AATTC）。 ⑶ 野生型只能接纳一定长度的DNA。若相当于λ噬菌体的75-105%，那么只能接纳49kb×5%=2.45kb的DNA。 λ噬菌体的改造 (1)切去非必须区段，在切去的同时，加载目的基因（2.5kb或更大）； (2)去除太多的酶位点，每种酶只留1-2个切口； (3)增加标记基因（remarke gene）。 (4)引入无义突变． 3. λ噬菌体的主要类型 （1）插入型载体 只有1～2种限制性核酸内切酶的单一切割位点 免疫功能失活 大肠杆菌β-半乳糖苷酶失活 （2）替换型载体 在其中央部位有一个可以被外源插入的DNA分子取代的DNA片段的克隆载体 。这是由于构建此载体时，安排在中央可取代片段两侧的多克隆位点是反向重复序列，因此，当外源DNA插入时，一对克隆位点之间的DNA片段便会被置换掉，从而有效提高了克隆外源DNA片段的能力。 （二）M13噬菌体载体 M13噬菌体属丝状噬菌体，其基因组为闭合环状正链ssDNA，6407bp，其中90%的DNA都编码蛋白质，有10个基因，有两个较长的间隔区，是外源基因插入的部位。 噬菌粒载体（科斯质粒 cosmid ） 1、构建 由质粒和λ噬菌体的粘性末端构建而成的。借用cos-（粘性尾巴）作字头，质粒的-mid作字尾，故称Cosmid，也叫粘粒载体。 2、特点 (1)有λ噬菌体的高效感染能力。 (2)有质粒的高效复制特性。 (3)有更广泛寄主。 (4)有较大的容量(35~45kb)。 3、主要用途：用于DNA 序列分析 酵母菌载体 多数酵母中含有一种能独立复制的环状双链DNA，称为2μ质粒，长约6.3kb，有单一的复制起始点和一个自主复制功能区域（ARS片段）。 特点： ①含有E.coli质粒的复制起始序列，这样在外源基因转到酵母细胞前可先在大肠杆菌中扩增。 ②含有酵母的筛选标记，这样当重组质粒转入相应的酵母细胞后，可用来筛选重组体。 ③具有合适的供外源基因插入的限制酶切割位点。 穿梭载体 可以认为这种克隆载体是质粒克隆载体的衍生物，由SV40的DNA片段与质粒重组而成。 优点：遗传背景清楚，容易制备，拷贝数高，病毒的早期功能及晚期功能都有温度敏感突变株等。 缺陷：①SV40重组病毒转染细胞，随着病毒的繁殖，细胞便裂解； ②容纳外源DNA能力较小，如构建晚期取代载体时，去掉一段晚期DNA后，插入的外源DNA不能大于2500bp。 ③存在安全隐患。 克隆载体：都有一个松弛型复制子，能带动外源基因在受体细胞中复制扩增 表达载体：是适合在受体细胞中表达外源基因的载体，它必须有强启动子和终止子，能够高效转录产生稳定的mRNA 基因与载体的连接（体外重组） 载体的连接方式 1 黏性末端连接 2 平端连接 3 人工接头连接 4 同聚核苷酸末端连接（同聚物加尾连接） 5 衔接物连接法 黏性末端连接 当载体DNA和目的基因均用同一种限制酶进行切断时，二者即可带有相同的粘性末端。如将载体与目的基因混合在一起，二者即可通过粘性末端进行互补粘合，再加入DNA连接酶，即可封闭其缺口，得到重组体。 较少的情况下，对产生的平端也可直接进行连接。 黏性末端连接 黏性末端连接 2.双酶切片段的定向克隆 优点： （1）外源DNA只能以一个方向定向插入到重组质粒，以便目的基因的正确转录和表达； （2）质粒载体与外源DNA结合处的限制酶切位点仍然保留，可随时从重组载体中通过相应的限制酶切割后分离和获得目的基因； （3）由于不会发生自身环化，转化率高，转化后的细菌克隆大多数携带有目的基因的重组质粒。 黏性末端连接 3.不同限制酶切位点的黏端连接 由两种不同的限制性核酸内切酶切割的DNA片段，具有相同类型的黏性末端，彼此称匹配末端，也可以产生类似单酶切位点的黏端连接方式一样的末端连接 1 同尾限制酶 2 同裂限制酶 除影响连接反应的一般因素外，黏性末端的长度、互补碱基的稳定性是影响连接效率的重要因素 平端连接 一些内切酶如HaeIII 和 Hpa I 切割产生的DNA片段没有黏性末端，而是平末端。 平端连接比黏性末端连接困难得多，其连接效率很低，只有黏性末端的1% 多联体连接中，常常增加DNA的浓度，同时用数倍于黏性末端的连接酶处理 如果靶序列和载体上没有相同的限制性内切酶位点可以利用，用不同的限制性内切酶切割后的黏端不能互补结合： 平—黏端连接 （1）添补法：即对5’-突出黏性末端补齐 （2）消除法：即对3’-突出黏性末端削平 人工接头连接 将人工连接器（即一段含有多种限制酶切点的DNA片段）连接到载体和目的基因上，即有可能使用同一种限制酶对载体和目的基因进行切断，得到可以互补的粘性末端。 同聚核苷酸末端连接（同聚物加尾连接） 当载体和目的基因无法采用同一种限制酶进行切断，无法得到相同得粘性末端时，可采用此方法。 此法首先使用单链核酸酶将粘性末端切平，再在末端核苷酸转移酶的催化下，将脱氧核糖核苷酸添加于载体或目的基因的3‘-端 如载体上添加一段polyG，则可在目的基因上添加一段polyC，故二者即可通过碱基互补进行粘合，再由DNA连接酶连接。 衔接物连接法 衔接物是指用化学方法合成的一段由 10-12 个核苷酸组成、具有一个或数个限制酶识别位点的平头末端的双链寡聚核苷酸片段。 将衔接物的 5' 末段和待克隆的 DNA 片段的 5' 末端用多核苷酸激酶处理使之磷酸化，然后通过T4 DNA 连接酶使两者连接起来。接着用适当的限制酶消化具有衔 接物的 DNA 分子和克隆载体分子，结果使二者都产生出了彼此互补的粘性末端。随后按常规的粘性末端连接法，将待克隆的 DNA 片段同载体分子连接起来。 重组DNA导入到受体细胞 重组DNA导入到受体细胞（基因转移） 外源基因与载体在体外连接形成重组DNA后，需要将其导入到受体细胞进行扩增和筛选以得到大量的，单一的重组体分子即外源基因的无性繁殖或称为克隆。 转化(transformation) 转染(transfection) 电转化(electrotranformation ) 显微注射技术(microinjection) 基因枪技术(geneblaster technique ，微弹技术 microneblast technique） 脂质体介导法(liposome mediated gene transfer) 其他方法（例如：超声波介导法 ，碳化硅纤维介导法等 转化 将重组质粒DNA导入受体细胞，使受体细胞遗传性状发生改变的方法。一般情况下转化指的是重组质粒对大肠杆菌的转化。 感受态细胞的制备 a、首先，使受体菌处于感受态。 b、吸附：完整的双链DNA分子吸附在受体菌表面。 c、转入：双链DNA分子解链、单链DNA进入受体菌，另一链降解。 d、自稳：外源质粒DNA分子在细胞内又复制成双链环状DNA。 e、表达：供体基因随同复制子同时复制并转录，翻译。 转染 转染即将重组λ噬菌体DNA导入受体细胞的过程 。 由于λ噬菌体载体的分子质量较大，再加上重组的外源DNA分子，重组的λ噬菌体DNA长度可达到48–51kb，这么大的重组DNA分子直接用于转染时，效率较低，λ噬菌体DNA直接转染的效率只有105-106，即每μgλ噬菌体DNA转染受体细菌产生的噬菌体菌斑数目为105-106。这么低的转染效率很难达到实验要求。 一般情况下将λ噬菌体DNA导入大肠杆菌受体细胞的常规方法是转导操作，即通过体外包装，把重组的噬菌体DNA与抽提物（包装蛋白）混合，经过适当条件的温育形成λ噬菌体（病毒）颗粒，感染宿主细胞的途径把外源DNA分子转移到受体细胞的过程。 噬菌体DNA的体外包装 转导 电转化法 在受体细胞上施加短暂，高压的电流脉冲，使其在质膜上形成纳米微孔，重组DNA通过这些微孔进入到宿主细胞的过程。 电转化的效率受电场强度，电脉冲时间和外源DNA浓度等参数的影响，通过优化这些参数，转化效率可以达到109-1010个转化子，比氯化钙转化法高10-20倍，对磷酸钙以及其他技术难以转化的细胞系，电穿孔法仍使用。 电转化过程 电转化仪 显微注射法 一种利用显微注射仪，通过机械方法，把外源DNA直接注入细胞质或者细胞核的基因转化方法。 这一技术的关键是原生质体或者细胞团的固定，由于动物细胞具有贴壁生长特征，因此不存在固定细胞的问题，这为动物细胞的显微注射创造了十分有利的条件。但对植物细胞而言，首先必须建立固定细胞技术，然后才能进行定位显微注射操作。 细胞固定的方法 基因枪法 利用高速运行的金属颗粒轰击细胞时，将包裹在金属颗粒表面的外源DNA分子随之带入细胞进行细胞内的现象。 DNA 吸附 1.2μml钨粒 装入特质手枪 射击受体细胞 基因枪系统 脂质体介导法 人工构建的磷脂双分子层组成的膜状结构，可以将DNA包在其内，并通过脂质体与原生质体的融合或由于原生质体的吞噬作用，把外源DNA转运到细胞内。 脂质体介导过程 超声波介导转化法 。 总结 四、重组体克隆的筛选与鉴定 1.根据重组载体的标记做筛选 蓝白斑筛选法 2.根据标志互补进行筛选： 3.根据DNA限制酶谱进行分析： 经过粗筛后的含重组体的细菌，还需进行限制酶谱分析进一步鉴定。 单一细菌--扩增-提取DNA-限制酶酶切-电泳 4.菌落杂交筛选法 为了进一步鉴定重组基因体中的目的基因，可采用与目的基因部分互补的DNA片段作为探针，与含有重组体的细菌菌落进行杂交，经放射自显影，如结果为阳性，即可确定重组体中带目的基因。 原理：带有插入片段的重组体在相对分子质量上会有所增加，分离质粒DNA并测定其分子长度是一种直截了当的方法。 6.PCR 法 PCR技术的出现给克隆的筛选增加了一个新手段。如果已知目的序列的长度和两端的序列，则可以设计合成一对引物，以转化细胞所得的DNA为模板进行扩增，若能得到预期长度的PCR产物，则该转化细胞就可能含有目的的序列。 核酸序列的测定 所得到的目的序列或基因的克隆，都要用其核酸序列测定来最后鉴定。已知序列的核酸克隆要经序列测定确证所获得的克隆准确无误；未知序列的核酸克隆要测定序列才能确知其结构、推测其功能，用进一步的研究。因此核酸序列测定是分子克隆中必不可少的鉴定步骤。 表达体系的介绍 原核细胞表达体系 原核细胞表达体系 原核细胞表达体系 高效表达外源基因的策略（以E.coli为例） 1.选用强启动子和强终止子 2.SD序列优化 3.增加外源基因mRNA稳定性 4.避免使用大肠埃希菌罕见密码子 5.提高表达蛋白的稳定性 6.减轻外源基因表达对宿主细胞的代谢压力 7.优化发酵过程 真核细胞表达体系 真核细胞表达体系 真核细胞表达体系 高效表达外源基因的策略（以E.coli为例） 1.Mut+与Muts转化子（醇氧化酶）的选择 2.多基因拷贝整合的转合子 3.外源基因的序列特性也会影响其在毕赤酵母 4.胞外蛋白酶可能造成分泌表达蛋白的降解 5.细胞内表达或者分泌表达方式选择 6.用发酵罐大规模发酵表达可以明显提高目标蛋白的表达量。 寻找新型表达体系 体外表达 借助聚合酶体外转录PCR产物，可以很简单高产地获得足量的mRNA，甚至戴上真核mRNA特有的“帽子”； 加入特定的细胞裂解物，利用其中的核糖体、合成酶、tRNA、翻译起始、延伸、终止因子、氨基酸等等蛋白质合成的必需元件 在适合的温度下就可以体外合成蛋白质。 体外表达 体外表达 体外表达 灵活：任何系统均可匹配任何基因。 方便：自动化操作。 此外，避免了过量表达对细胞的毒性；不会形成不溶的包含体；同时避免了表达产物在细胞内的降解；又能减少了蛋白变性复性的困扰；还可以在添加特殊的修饰氨基酸或者标记氨基酸，研究蛋白质高级结构和功能 。 体外表达 体外表达 原核系统 主要利用大肠杆菌的提取物进行表达。 体外表达 真核系统1-兔网织红细胞体外表达体系 （1）应用得较早 （2）由红细胞分化而来，体内负责合成大量血红蛋白（90%以上），以及球蛋白。 （3）背景很少，即使在较低的丰度下也能比较高效地合成产物。 内源的核酸酶很少，有助于长链RNA的稳定，可以合成较大的蛋白。 体外表达 真核系统2-麦芽提取物体外表达体系 （1）内源的mRNA很少，可用于各种病毒、酵母、高等植物乃至哺乳动物蛋白的合成。 （2）要求RNA有帽子结构才能翻译。 （3）广泛用于放射标记多肽和蛋白的合成。 （4）适合进行高通量的蛋白质组学研究。 体外表达 体外表达目前应用领域 体外表达目前应用领域 具体实例 Contents 课题：重组人白细胞介素4在大肠杆菌中的表达 1、对IL- 4基因进行优化 构建三种工程菌 表达载体pET30a(+)/IL-4的构建 表达载体pBAD/gIII/IL-4的构建 表达载体pBAD/IL-4的构建 表达宿主菌BL21(DE3)的CaCl2转化与鉴定 BL21(DE3)/pET30a(+)/IL-4表达鉴定 BL21(DE3)/pET30a(+)/IL-4重组蛋白表达定位研究 TOP10/pBAD/gIII/IL-4表达鉴定 TOP10/pBAD/gIII/IL-4重组蛋白表达定位研究 Hot Tip TOP10/pBAD/IL-4表达鉴定 TOP10/pBAD/IL-4重组蛋白表达定位研究 高效稳定表达工程菌的筛选 表达工程菌的发酵培养 Hot Tip Diagram rhIL- 4分离纯化简要流程
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