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简介
这是双向电泳ppt，包括了蛋白质电泳的基本原理，影响电泳速度的因素，电泳的分类，聚丙烯酰胺凝胶电泳，基本原理，载体两性电解质pH梯度等电聚焦电泳，固相pH梯度等电聚焦电泳技术，SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，IPG IEF 中pH梯度的选择等内容，欢迎点击下载。
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*1809年俄国物理学家Peйce首次发现电泳现象。 *1909年Michaelis首次将胶体离子在电场中的移动称为电泳。 他用不同pH的溶液在U形管中测定了转化酶和过氧化氢酶的电泳移动和等电点。 *1937年瑞典Uppsala大学的Tiselius对电泳仪器作了改进，创造了Tiselius电泳仪，建立了研究蛋白质的移动界面电泳方法，并首次证明了血清是由白蛋白及α、β、γ球蛋白组成的，由于Tiselius在电泳技术方面作出的开拓性贡献而获得了1948年的诺贝尔化学奖。 *1948年Wieland和Fischer重新发展了以滤纸作为支持介质的电泳方法，对氨基酸的分离进行过研究。 *从上世纪50年代起，特别是1950年Durrum用纸电泳进行了各种蛋白质的分离以后，开创了利用各种固体物质（如各种滤纸、醋酸纤维素薄膜、琼脂凝胶、淀粉凝胶等）作为支持介质的区带电泳方法。 *1959年Raymond和Weintraub利用人工合成的凝胶作为支持介质，创建了聚丙烯酰胺凝胶电泳，极大地提高了电泳技术的分辨率，开创了近代电泳的新时代。 *由80年代发展起来的新的毛细管电泳技术，是化学和生化分析鉴定技术的重要新发展，己受到人们的充分重视。 *双向电泳由O’Farrell’s于1975年首次建立并成功地分离约1000个E.coli蛋白。 第一节 蛋白质电泳的基本原理 一、电泳的基本原理 1、在电场作用下，带电颗粒向着与其电性相反的方向移动的现象称为电泳（electrophoresis)。 由F = Eq，f = 6πr υ η 可得υ=Eq/(6πr η) 2、带电颗粒的泳动速度同电场强度和分子本身所带的净电荷量成正比，与颗粒半径和介质黏度成反比。 蛋白质是一种两性电解质。其泳动速度取决于蛋白质分子所带电荷的性质、数量以及颗粒的大小和形状。 二、影响电泳速度的因素 1、电场强度；2、缓冲溶液的pH；3、缓冲溶液的离子强度；4、电渗；5、焦耳热 三、电泳的分类 按原理分类： 自由界面电泳：又称移动界面电泳，是指在没有支持介质的溶液中进行的电泳。其装置复杂，价格昂贵，费时费力，不便于推广应用。 稳态电泳（或称置换电泳）：分子颗粒的电泳迁移在一定时间达到一个稳态后，带的宽度不随时间而变化。 区带电泳：是指有支持介质的电泳，待分离物质在支持介质上分离成若干区带。支持介质的作用主要是防止电泳过程中的对流和扩散，以使被分离的成分得到最大分辨率的分离。区带电泳由于采用的介质不同以及技术上的差异，又可分为不同的类型。 ③淀粉凝胶电泳：多用于同工酶分析，凝胶铺厚些，可一层一层剥层分析（一板多测）。天然淀粉经加工处理即可使用，但孔径度可调性差，并且由于其批号之间的质量相差很大，很难得到重复的电泳结果，加之电泳时间长，操作麻烦，分辨率低，实验室中已很少使用。 ④琼脂糖凝胶电泳：一般用于核酸的分离分析。琼脂糖凝胶孔径度较大，对大部分蛋白质只有很小的分子筛效应。 ⑤聚丙烯酰胺凝胶电泳：可用于核酸和蛋白质的分离、纯化及检测。其分辨率较高。 聚丙烯酰胺和琼脂糖是目前实验室最常用的支持介质。 另外根据支持介质形状不同，区带电泳可分为：薄层电泳、板电泳、柱电泳。 根据用途不同，可分为：分析电泳、制备电泳、定量电泳、免疫电泳。 按pH的连续性不同，可分为：连续pH电泳，不连续pH电泳。 四、聚丙烯酰胺凝胶电泳 第二节 蛋白质等电聚焦电泳 1966年，瑞典科学家Rible和Vesterberg建立。 等电聚焦：isoelectric focusing，IEF。 1.电泳系统中加进两性电解质载体，当通直流电时，两性电解质载体即形成一个由阳极到阴极连续增高的pH梯度。蛋白进入时，不同的蛋白移动到与其等电点相当的pH位置上，从而使不同等电点的蛋白得以分离。 2.优点：分辨率高，区带清晰、窄，加样部位自由，重现性好，可测定蛋白或多肽的等电点。 3.缺点：需无盐溶液，不适用于在等电点不溶解或发生变性的蛋白。 利用蛋白质分子或其他两性分子等电点的不同，在一个稳定的、连续的、线性的（或非线性）pH梯度中进行蛋白质的分离和分析。分析对象只限于蛋白质和其他两性分子。 根据建立pH梯度原理不同，可分为载体两性电解质pH梯度（carrier ampholyte pH gradient)和固相pH梯度(immobilized pH gradient， IPG)。 一、基本原理 1、蛋白质的等电点：取决于其氨基酸的组成。 组成每一种蛋白质或多肽的氨基酸的数目和比例是不同的，故蛋白质的等电点范围很宽，这使得可以利用它来分离和分析蛋白质。 二、载体两性电解质pH梯度等电聚焦电泳 1、载体两性电解质应具备的条件 在等电点处有足够的缓冲能力，以便能控制pH梯度，而不致被样品的缓冲能力而改变pH梯度。 在等电点处有足够高的电导，以便使一定的电流通过，具备不同pH的载体有相同的电导系数，是整个体系中的电导均匀。 分子质量小，便于与被分离的高分子物质分离。 化学组成不同于被分离物质，不干扰测定。 应不与分离物质反应或使之变性。 由多乙烯多胺与丙烯酸加成制备(有不同pH范围的商品两性电解质载体) 3、载体两性电解质分离原理 等电聚焦样品可放于任何位置。 4、载体两性电解质的缺点 载体两性电解质合成过程复杂，影响蛋白质点的位置，从而影响了重复性； 负极漂移现象，使pH梯度不稳定； 负极漂移现象使碱性蛋白质无法聚焦； 凝胶灌制重复性差，凝胶机械稳定性差，影响重复性。 5、等电聚焦中应注意的事项 pH梯度的选择； 添加中性载体两性电解质； 电流降到最小切恒定时尽快结束IEF; pH梯度测定：电泳结束后，用微电机检测凝胶表面pH; 蛋白质在pI处形成沉淀。添加表面活性剂。 三、固相pH梯度等电聚焦电泳技术 第三节 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳 一、常规聚丙烯酰胺凝胶电泳 1、基本原理:天然状态生物大分子聚丙烯酰胺凝胶电泳（native PAGE），在恒定的、非解离的缓冲系统中分离蛋白质。可得到天然蛋白质的分子量。 二、SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳 1、基本原理 聚丙烯酰胺凝胶系统中加入十二烷基硫酸钠(sodium dodecylsulphate)SDS，蛋白电泳迁移率取决于其分子量，而与形状及所带电荷无关。 加入SDS和巯基乙醇后，巯基乙醇使蛋白的二硫键还原，SDS使氢键、疏水键打开，并结合到P分子上，形成蛋白-SDS，带上相同密度负电荷，形状为长椭圆形，短轴一定，长轴长度正比于蛋白分子量。 分离测定： 测分子量(与标准蛋白比较) 鉴定样品纯度(条带数目) 测定样品蛋白含量：扫描定量(比色) 第四节 双向电泳 一、基本原理 IEF-SDS-PAGE 双向电泳的分类 非变性2D-PAGE：两向均在非变性条件下进行，这样分离的蛋白质点的等电点和表观分子量同生理条件下获得的这些蛋白的值是一样的； 非变性/SDS-2D-PAGE：第一向采用非变性IEF，之后在2%SDS溶液中平衡；第二向也在SDS存在的条件下进行。适于分析非共价键连接的蛋白－蛋白间的相互作用。 非变性/还原/SDS-2D-PAGE：非变性条件下IEF聚焦，之后用8M尿素＋5%β-ME＋2%SDS进行平衡，再进行第二向SDS-PAG电泳。此时分离的蛋白质点可进行点的切取、蛋白酶消化、MALDI-TOF-MS分析鉴定，提供关于断裂二硫键连接的多肽的信息。 变性2D-PAGE：样品先用2%SDS＋5%β-ME＋95℃变性5min，IEF在8M尿素＋1%NP-40条件下进行，之后胶条用2%SDS＋5%β-ME平衡，然后进行SDS-PAGE。该技术适于DNA序列和多肽结构的分析，或分析被碳氢键连接和其它翻译后修饰所引起的多肽结构微异质性，但此方式显示的大于100Kd的蛋白质点少于第三种方式 一维固相pH梯度等电聚焦（IEF with IPG）： IPG胶的材料是Immobilines，为拥有CH2=CH-CO-NH-R结构的8种丙烯酰胺衍生物系列，其中R包含羧基或叔氨基团，它们构成了分布在pH3~10不同值的缓冲体系。根据公布的配方计算后，将适宜的IPG试剂添加至混合物中用于凝胶聚合，在聚合中缓冲基团通过乙烯键共价聚合至聚丙烯酰胺骨架中而形成pH梯度。通过这种方式生成的IPG不会发生电渗透作用，因而可以进行特别稳定的IEF分离达到真正的平衡状态。 IPG胶条的重泡胀 泡胀的实质：是让样品能完全以可溶性的形式进入IPG内，从而能进行接下来的IEF。 不同的加样方法和加样量会导致最终结果的差异： Protean IEF cell、IPGphor等集成设备的使用： 20mmol/L DTT 垫片的使用： 温度的选择： 蛋白载样量 影响IPG胶条对蛋白载样量的因素包括： 待分析的蛋白点的量应满足随后的质谱分析。 电泳的目的：如果只是得到一张好的图片，则无需考虑太多其它因素。 待研究蛋白的丰度： 样品的复杂度：复杂度较高的样品，为了尽可能的了解所包含的每种蛋白，需要反复实验才能完成。如果将待检样品被富集以后则更易分析。 IPG胶条的pH范围： IPG IEF 中pH梯度的选择 常用方法：先宽后窄，先线性后非线性，先短后长，预试验确定。
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