艾滋病防治培训课件

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HIV抗体、梅毒筛查技术
平昌疾控   李勇
2011.04.21
HIV抗体筛查依据：《全国艾滋病检测技术规范》（2009年修订版） 《全国艾滋病检测工作管理办法》
艾滋病检测实验室的管理
国家对艾滋病检测实验室实行分类管理，按照实验室的职能、开展检测工作的性质及范围共分三类实验室，分别是艾滋病参比实验室、艾滋病检测确证实验室、艾滋病检测筛查实验室（包括：艾滋病筛查中心实验室、艾滋病筛查实验室和艾滋病检测点） 。
艾滋病检测点的申请和验收程序
   （一）申请设立艾滋病检测点的机构或单位应填写“艾滋病检测点资格审批申请表”（附件2），向当地区县卫生行政部门提出申请，经区县卫生行政部门批准后报市（州）卫生行政部门审批。
（二）艾滋病检测点基本标准
  1.人员条件：至少由2名经过市（州）级以上艾滋病检测技术培训并获得培训证书的专业人员组成。
  2.建筑条件：需有艾滋病检测区域或专用实验台，能开展简便、快速检测。
  3.设备条件：需配备快速试验所必须的物品，包括加样器、普通冰箱、操作环境温度控制设备、消毒与污物处理设备、一次性消耗品、安全防护用品。
（三）对符合规定、材料齐全的申请者，由所在市（州）卫生行政部门指定2人以上人员组成的艾滋病检测点评审专家组（专家组成员必须经过省级以上艾滋病检测相关培训）根据本方案艾滋病检测点基本标准对申报单位进行现场验收，同时使用5份盲样对其进行实验操作及结果判读进行现场操作考核。
（四）专家组对通过现场验收的检测点报请市（州）卫生行政部门批准及备案。
（五）市（州）级卫生行政部门对通过验收者发出批复通知，同时抄送省卫生厅、省疾病预防控制中心和市（州）疾病预防控制中心，未通过验收者整改后可重新提出申请。
基 本 概 念
HIV形态与结构
HIV呈球形，直径100-120nm
内含RNA分子及酶（逆转录酶、整合酶喝蛋白酶）
外层有包膜，膜上为突起插入，突起由糖蛋白（gp120）和跨膜蛋白（gp41）以共价键连接而成。
HIV基因：3个结构基因和6个调节基因
3个结构基因：env、gag、pol表达的蛋白：
      env---gp160、 gp120、gp41
      gag---p55、p24、p17
      pol---p66、p51、p31
HIV感染机理（一）
HIV病毒侵入人体后，其表面糖蛋白gp120与细胞表面受体蛋白CD4以高亲和力结合，吸附到宿主细胞上；gp120再与宿主细胞表面辅助受体相互作用，使病毒与宿主细胞膜更接近；gp41产生一系列构象变化，其N端的融合肽片段插入宿主细胞膜，导致病毒包膜与细胞膜的最终融合，病毒RNA进入细胞。
在HIV感染后，最先能够监测到病毒RNA、然后是p24抗原，最后是抗体。
HIV感染机理 （二） 
感染HIV后，机体针对HIV基因编码的抗原性物质产生相应抗体，在临床上具有重要诊断学意义的主要是对抗结构基因编码抗原(如gpl60，gpl20，gp41，p66，p55，p51，p31，p24，p17等)的抗体。
    由于个体差异、各种病毒蛋白的浓度和抗原性强弱不同及不同个体对不同抗原成分的反应性均有所不同，因此相应抗体的产生时间和不同个体对相同抗原成分的免疫应答强度等存在一定差别，此外，检测方法和使用试剂的敏感性不同对HIV抗体的检出时间产生一定影响。在感染HIV后，患者血清中最先出现p24抗原，继之，各种HIV抗原可达到高峰；2-6周后，随着HIV-l抗体产生及浓度的不断增加，HIV抗原渐趋降低或检测不出。临床通用ELISA、免疫印迹法（WB）和目前开始推广的快速诊断法检测HIV抗体。
HIV感染的主要检测方法（一）
目前检测HIV的方法很多，总体来说可以分为抗体检测和病毒检测两大类。病毒检测包括细胞培养(病毒分离)、p24抗原检测和病毒核酸检测。
早期对HIV的诊断主要是通过血清学试验检测抗HIV的抗体,间接地诊断HIV感染。
近几年，分子生物学方法不断被应用到HIV的检测中，HIV的实验室诊断方法取得了很大的进展，核酸检测已经成为了HIV实验室诊断的发展方向。
HIV感染窗口期
窗口期的问题？抗体通常是在感染后3～8周能够被检测出来。95%在三个月可以检测出抗体。
在窗口期，病毒抗体不能被检出，但可以检测到病毒相关抗原或分离病毒。抗原能够在个体感染后先于血清转化2～18 d被检测到。因此，在血清转化期通过检测p24抗原作为早期辅助诊断HIV感染的一种方法。
HIV感染的主要检测方法（二）--HIV抗体检测
检测抗-HIV抗体是HIV/AIDS诊断的一项重要指标，抗-HIV抗体测定作为血清学诊断要求准确、可靠，必须经初筛、复检试验和确认实验三个步骤。
       初筛实验方法主要有：酶联免疫试验（ELISA）、明胶颗粒凝集试验（PA）、快速免疫（层析或渗滤）试验（RT）。
       确认试验主要用免疫印迹试验（ WB）。
HIV检测程序及流程图
筛查试验: 标本验收合格后，用筛查试剂进行检测，如呈阴性反应，报告HIV抗体阴性；对呈阳性反应的标本，须进行重复检测
复检:对筛查呈阳性反应的标本用原有试剂和另外一种不同原理或不同厂家的试剂重复检测。如两种试剂复测均呈阴性反应，则报告HIV抗体阴性；如均呈阳性反应，或一阴一阳，需送艾滋病确认实验室进行确认。
应尽可能将重新采集的受检者血液标本和原有标本一并送检。
酶联免疫吸附试验(ELISA)
基本原理:是免疫反应物通过化学或免疫学的方法形成酶结合物，酶结合物能与待检样品中相应的抗原或抗体结合成为免疫复合物,然后加入酶底物,经酶的催化或水解作用,无色底物产生颜色,用肉眼、酶标仪观察结果。由于酶的催化效率很高，间接地放大了免疫反应的结果，使测定方法达到很高的敏感度。
初筛用的HIV ELISA试剂目前已经发展到第四代检测试剂。
        第一代试剂主要以病毒裂解物或部分纯化的病毒抗原包被反应板,以检测血清中的抗体。由于包被的抗原不很纯,假阳性率较高。
    第二代试剂使用基因工程方法得到的重组抗原和合成肽包被反应板，由于纯化抗原的使用,特异性有了很大提高。
    第三代试剂使用双抗原夹心法检测抗体,进一步提高了敏感性。--目前国内外主要使用第三代
    第四代试剂则在第三代的基础上进一步增加了P24抗原的检测,把HIV抗原和抗P24的抗体同时包被反应板,可同时检测血清中的HIV抗体和P24抗原。检出时间提前了4-9.1d，用于血源筛查等。
HIV抗体筛查试验基本要求
筛查试剂必须是经国家食品药品监督管理局注册批准、批检合格、临床评估质量优良、在有效期内的试剂。
目前常用的筛查试剂有酶联免疫、颗粒凝集和其它快速诊断试剂。
建议采用国家参比室试剂考评质量优良的试剂--中国疾病预防控制中心性艾中心网站
快速检测（RT）（1）
常用的主要有以下几种：
明胶颗粒凝集试验（PA）：PA是HIV血清抗体检测的一种简便方法，是将HIV抗原致敏明胶颗粒作为载体，与待检样品作用，混匀后保温（一般为室温）。当待检样品含有HIV抗体时，经抗原致敏的明胶颗粒与抗体发生抗原-抗体反应，根据明胶颗粒在孔中的凝集情况判读结果。
斑点EIA或称斑点ELISA（dot-EIA）：以硝酸纤维膜为载体，将HIV抗原滴在膜上成点状，即为固相抗原。加血清样品作用，以后步骤同ELISA。阳性结果在膜上抗原部位显示出有色斑点。反应时间在10 min以内，使用抗原量少。
快速检测（RT）（2）
斑点免疫胶体金（或胶体硒）快速试验
    金标纸条采用双抗原夹心法免疫测定原理，选择经纯化的基因工程制备的gp36、gp41、p24抗原作为包被抗原和gp41、gp36基因工程抗原和p24合成肽作为胶体金结合抗原。
    当待检标本中含有HIV抗体时，先和金标记抗原结合，由于层析作用反应复合物沿硝酸纤维膜向前移动，当遇到包被抗原时，形成Ag-Ab-Ag-Au复合物而富集在包被线上，形成红色沉淀线。同时在包被膜上还有一条质控线对照，故当有两条红线时判为阳性，只有一条红线时，判为阴性。
    该方法试剂稳定，可室温长期保存。试验时不需任何设备，迅速、简便、特异性较好，敏感性约相当于中度敏感的ELISA，适用于应急检测、门诊急诊个体检测，尤其是基层单位。
样本要求
1.采集静脉血清或血浆，并避免样品溶血。
2.如果血清或血浆样本收集后7天内检测，样品须放在2-8℃保存，如果大于7天则须冷冻（-20℃）保存。
3.如果要使用血浆样本，需使用EDTAK2或EDTAK3抗凝，使用其他抗凝剂的血浆样本可能会得到不正确的结果。【建议最好不使用肝素钠抗凝剂的血浆标本】。
胶体金快速试验-操作步骤
1、将待测标本从储存条件下取出，平衡至室温并编号。
2、将所需数量的测试卡从包装盒中取出平衡至室温，打开铝箔包装袋，平置于台面上。
3、用微量加样器取50µI检测样本，加到测试卡的加样处。【也可以用试剂包装中自带的一次性滴管滴加测试标本2滴】。
4、加样后， 30分钟内（从加样后计时起）最终观察并记录测试结果。
胶体金快速试验-结果判断
     1、阳性：测试卡在检测区（T）和对照区(C)位置各出现一条紫红色条带（共2条红色带），判为阳性。
 【特别注意：测试区（T）内的紫红色条带可呈现颜色深浅的现象。在规定的观察时间内，不论该色带颜色深浅，即使只有非常弱的色带也应判定为阳性结果。检测线颜色的深浅的程度与样品中抗体的滴度没有一定的必然联系。阳性标本必须使用其他方法确认。】
  2、阴性：测试卡只在对照区(C)位置出现一条紫红色条带。
  3、失效：对照区(C)未出现紫红色条带，表明不正确的操作过程或试剂盒已变质损坏或者是样本中抗体的含量过高。在此情况下用新的测试卡重新测试。如果问题仍然存在，应立即停止使用此批号试剂。
阴性反应
注意事项（一）
1、金标快速测试卡仅用于HIV抗体的现场初筛，对于所有使用本测试卡检测结果为阳性的样品必须进行进一步确证【阳性标本请填写《艾滋病检测点HIV抗体复检检测单》及时送县疾控中心复核检测】。初筛结果不得出具阳性报告。
2、本测试卡仅用于人血清（浆）标本中HIV抗体的检测，其它体液和样品可能得不到准确的结果。所以必须使用符合要求的检测标本。
3、样本的加样建议用微量加样器按试剂说明书准确加入。
4、实验环境应保持一定温湿度，避免在过高温度下进行实验
注意事项（二）
检测过程中生物安全要求
  ◆检测过程应将所有检测标本视为有感染危险的标本
（1）、采血和测试过程中一定要带手套，采血取出针头时要绝对避免针头刺伤：不许用手直接套回针头防护套；避免直接接触血液；
◆如遭抽过血的针头刺伤，应立即将伤口的血挤出，先用肥皂和清水冲洗伤口，再用75%酒精等彻底洗洁，并按HIV职业暴露后预防的相关程序处理；
◆衣物沾上血迹要用75%酒精湿润的纸巾檫掉，然后用75%酒精湿透；
（2）不可在检测过程中吸烟、进食、喝饮料、美容和处理隐形眼镜；
（3）用消毒剂对溅出的样品或试剂进行消毒。
似疑阳性标本的送检要求（一）
1、全血标本必须分离出血清或血浆，装入带螺旋口的样品冻存管中送检。【严禁全血标本送检】
2、血清或血浆标本的量不能少于1ml 。避免溶血标本送检。
3、标本送检时必须全项目填写《艾滋病检测点HIV抗体复检检测单》，标本人的姓名必须与本人身份证的名字一致，不得使用同音字。特别注意标本人身份证号的准确填写。并附标本人的身份证或者户口薄复印件一并上送。
似疑阳性标本的送检要求（二）
4、送检标本的包装：
*标本管上必须有明确的标识(包括姓名、编号、采血日期等)；
*标本管一定要旋紧螺旋盖，先装入放渗漏的小塑料袋中，然后放入配发的专用送样瓶中，周围用泡沫等软物固定，放入冰袋，盖紧送样瓶盖子。
*注意严禁将送检单等送检资料放入样品瓶中送检，样品必须与送检资料分离送检。
梅毒－实验室检查方法
一、暗视野检查/镀银染色法
二、非梅毒螺旋体抗原血清试验
三、梅毒螺旋体抗原血清试验
暗视野检查/镀银染色法
    -- 当标本阳性时，可确诊梅毒。
适宜于早期梅毒(一、二期)，特别是早期一期梅毒、早期先天梅毒 。
暗视野显微镜检查法被WHO确定为性病实验室的必备方法
当标本阴性时，不能排除梅毒诊断
不适用于来至口腔的标本
暗视野显微镜检查法是能够立即在获得性或先天性梅毒的早期进行直接诊断的唯一标准
非梅毒螺旋体抗原血清试验
非梅毒螺旋体抗原血清试验：是以心磷脂、卵磷脂及胆固醇作为抗原检查病人血清中反应素的试验方法。一般用于初筛试验及疗效观察。
常用方法：
    VDRL（性病研究试验试验）
    RPR(快速血浆反应素卡片试验)
    TRUST(甲苯胺红试验)
    USR(不加热血清反应素试验)
   *缺点：敏感性――一期梅毒稍低
                 特异性――可出现假阳性
    *优点：可观察疗效、再感染，价廉，出结果快，操作             简单。
梅毒螺旋体抗原血清试验
梅毒血清学实验生物学假阳性的常见原因
                   非梅毒螺旋体抗原血清学实验       梅毒螺旋体抗原血清学实验
感染因素 细菌性心内膜炎                                      传染性单核细胞增多症
                            软下疳                                                    麻风
                         病毒性肝炎                                                    疟疾
                    传染性单核细胞增多症                                   莱姆病
             结核、麻风、麻疹、疟疾、水痘 
                支原体或肺炎双球菌肺炎 
非感染因素     妊娠                                          结缔组织病，如系统性红斑狼疮
                          使用毒品                                             甲状腺炎
                          恶性肿瘤 
                   结缔组织病，如系统性红斑狼疮 
                        多发性骨髓瘤 
                        慢性肝脏损害 
                             衰老
★职业暴露
概念：艾滋病的职业暴露是指医务工作者、实验室工作人员及有关监管人员在从事HIV/AIDS诊断、治疗、护理、预防、检验、管理工作过程中，暴露于含有HIV的血液、体液和实验室培养液，而具有被HIV病毒感染的可能的情况而引起的危害。
广义的职业暴露
艾滋病的职业暴露后预防
1、急救　如有伤口，立即挤压，尽可能挤出损伤处的血液。用肥皂和清水冲洗伤口或玷污的伤口的皮肤。如果是黏膜暴露，应用生理盐水反复冲洗 ，伤口应用消毒液（如75％酒精、2000mg/L次氯酸钠、0.2％－0.5%过氧乙酸、0.5%碘伏）侵泡或涂抹消毒，并包扎伤口。
2、立即报告单位领导，并迅速报县CDC,启动暴露评估；
3 、暴露危险的评估—分轻度暴露和重度暴露两级；
4 、暴露源的评估—分HIV阳性1类、HIV阳性2类两种种；
5、预防性用药的推荐处理方案（略）。
暴露后预防性用药
预防性用药应在暴露后立即开始，一般在1小时之内服药效果最好。对于感染危险性很高的暴露者，即使间隔时间很长，如1－2周，也应考虑使用预防性治疗；因为即使不能防止感染，早期治疗对HIV急性感染也有好处。
*为避免给当事人带来不必要的压力，意外暴露发生后，最好仅向部门主管（科室负责人）和单位主要领导报告，有关知情者应为当事人严格保密。
暴露者应在暴露当时、及暴露后4W、8W、12W、6个月定期抽血检测HIV抗体
平昌县疾控中心
艾滋病筛查室
电话：6229956（检验科）
          13881661866（李勇）