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简介
这是三代测序ppt，包括了第三代测序技术的出现，第三代测序技术原理，第三代测序技术特点，三代测序技术的比较，第三代测序技术的应用，附：第四代测序技术等内容，欢迎点击下载。
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第三代测序技术 第三代测序技术是指单分子测序技术。DNA测序时，不需要经过PCR扩增，实现了对每一条DNA分子的单独测序 一 第三代测序技术的出现 二 第三代测序技术原理 三 第三代测序技术特点 四 三代测序技术的比较 五 第三代测序技术的应用 附：六 第四代测序技术 一 第三代测序技术的出现 第二代测序 自从2006年第一台454 GS FLX测序平台上市以来，基于非Sanger测序原理的第二代高通量测序 (next-generation sequencing， NGS) 技术迅速成为了基因组学研究的重要工具，其中包括Illumina Solexa、ABI SOLiD、Roche 454以及Life Tech的半导体测序仪Ion Torrent PGM & Proton。这些平台原理各有不同，在通量、读长、准确度、速度和成本方面各具优势，均在基因组de novo，重测序、转录组、表观遗传学研究中发挥了重要作用，并逐渐应用于个性化医疗和遗传诊断等临床服务 第三代测序 另一类非Sanger原理的DNA测序技术在2008年成为现实，这类基于单个分子信号检测的DNA测序被称为单分子测序 (single molecule sequencing， SMS)，或第三代测序 (third generation sequencing， TGS)。据预测，SMS将比NGS具有更快的速度和更低的成本，从而使研究人员能够实现目前无法进行的研究工作。尽管从现在的进展来看，SMS还未能完全实现预期目标，但已经做出了许多重要的努力。这些新技术包括Helicos的tSMS，PacBio的SMRT，Oxford的Nanopore以及其它一些尚处于实验室阶段的技术，如电镜测序，蛋白质晶体管测序等等。 二 第三代测序技术原理 第三代测序技术原理主要分为两大技术阵营：第一大阵营是单分子荧光测序，代表性的技术为美国螺旋生物(Helicos)的TSMS技术和美国太平洋生物(Pacific Bioscience)的SMRT技术。 第二大阵营为纳米孔测序，代表性的公司为英国牛津纳米孔公司。新型纳米孔测序法（nanopore sequencing）是采用电泳技术，借助电泳驱动单个分子逐一通过纳米孔 来实现测序的。 TSMS技术 tSMS是一种利用光学信号进行DNA碱基识别的边合成边测序 (sequencing by synthesis， SBS) 技术，与二代测序中的Illumina Solexa测序有类似之处，但该技术无需对样本进行PCR扩增，简化了测序文库的构建过程，也避免了DNA扩增中出现的错误。 Helicos Bioscience (MA， USA) 于2008年推出的HeliScope单分子测序平台被认为是第一个商品化的第三代测序仪。其测序原理tSMS是由斯坦福大学的S. R. Quake等科学家提出的。 SMRT技术 SMRT技术测序流程 纳米孔单分子技术 三 第三代测序技术特点 1、它实现了DNA聚合酶内在自身的反应速度，一秒可以测10个碱基，测序速度是化学法测序的2万倍。 2、它实现了DNA聚合酶内在自身的延续性，一个反应就可以测非常长的序列。二代测序现在可以测到上百个碱基，但是三代测序现在就可以测几千个碱基。 3、它的精度非常高，达到99.9999%。 4、直接测RNA的序列。既然DNA聚合酶能够实时观测，那么以RNA为模板复制DNA的逆转录酶也同样可以。RNA的直接测序，将大大降低体外逆转录产生的系统误差。 5、第二个是直接测甲基化的DNA序列。实际上DNA聚合酶复制A、T、C、G的速度是不一样的。正常的C或者甲基化的C为模板，DNA聚合酶停顿的时间不同。根据这个不同的时间，可以判断模板的C是否甲基化。 四 三代测序技术的比较 五 第三代测序技术的应用 基因组测序 甲基化研究 突变鉴定（SNP检测） 基因组测序 由于具有读长长的特点，SMRT测序平台在基因组测序中能降低测序后的Contig数量，明显减少后续的基因组拼接和注释的工作量，节省大量的时间[25]。Christophern等[26]仅仅用0.5*的Pacbio RS系统长度的数据与38*的二代测序(NGS)的测序数据，对马达加斯加的一种指猴基因组进行拼装，大幅度提高了数据的质量和完整度，同时借助Pacbio RS的帮助将原有的Contig数量减少了10倍。DavidA．等利用Pachio RS平台C2试剂通过全球合作几天内就完成了从德国大肠杆菌疫情中获得的大肠杆菌样品以及近似菌株的测序和数据分析，最终获得了2900bp的平均读长以及99.998%的一致性准确度。在对霍乱病菌的研究中，第三代测序技术已初现锋芒。研究人员对5株霍乱菌株的基因组进行了测序研究，并与其他23株霍乱弧菌的基因组进行对比。结果发现海地霍乱菌株与2002年和2008年在孟加拉国分离得到的变异霍乱弧菌ElTorO1菌株之间关系密切，而与1991年拉丁美洲霍乱分离株的关系较远。相对NGS的优势就是能更快获得结果，因此该系统在鉴定新的病原体和细菌的基因组测序方面得到很广泛的应用 甲基化研究 SMRT技术采用的是对DNA聚合酶的工作状态进行实时监测的方法，聚合酶合成每一个碱基，都有一个时间段，而当模板碱基带有修饰时，聚合酶会慢下来，使带有修饰的碱基两个相邻的脉冲峰之间的距离和参考序列的距离之间的比值如果大于1，由此就可以推断这个位置有修饰。甲基化研究中关于5?mC和5?hmC（5?mC的羟基化形式）是甲基化研究中的热点。但现有的测序方法无法区分5?mC和5?hmC。美国芝加哥大学利用SMRT测序技术和5?hmC的选择性化学标记方法来高通量检测5?hmC。通过聚合酶动力学提供的信息，可直接检测到DNA甲基化，包括N6?甲基腺嘌呤、5?mC和5?hmC，为表观遗传学研究打开了一条通路。 突变鉴定（SNP检测） 单分子测序的分辨率具有不可比拟的优势，而且没有PCR扩增步骤，就没有扩增引入的碱基错误，该优势使其在特定序列的SNP检测，稀有突变及其频率测定中大显身手。例如在医学研究中，对于FLT3基因是否是急性髓细胞白血病（AML）的有效治疗靶标一直存在质疑。研究人员用单分子测序分析耐药性患者基因，意外发现耐药性与FLT3基因下游出现的稀有新突变有关，重新证明了FLT3基因是这种最常见白血病—急性髓细胞白血病（AML）的有效治疗靶标，打破了一直以来对于这一基因靶标的疑惑。凭借PacBio平均3000bp的读长，获得了更多基因下游的宝贵信息，而基于单核酸分子的测序能够检测到低频率（低至1%）罕见突变，正是这项成果的关键所在 六 第四代测序技术——纳米孔测序技术 原理：分子在通过纳米孔道时，会对通过纳米孔的电流，或横穿过纳米孔的电流（隧穿电流）产生影响，而每种不同的分子通过时，对电流产生的影响具有可区别的差异。于是利用这种差异，纳米孔测序技术就可以识别基因中碱基（对）的排列顺序。 固态纳米孔测序法 虽然α溶血素七聚体相当不错，但用于悬浮纳米孔的磷脂双分子层并不稳定且难以操控。固体或是人造纳米孔被认为是下一代纳米孔技术一方面因为它们无需使用有机材料做支撑物，而主要是它们更加稳定。固态纳米孔还能在单个设备上平行地多重使用，这是生物纳米孔无法达到的。人造纳米孔组装在固态物质上，如氮化硅，硅或金属氧化物，及最近使用的石墨烯。石墨烯是一种新的单原子厚度的材料，是所知的最薄的膜。宾夕法尼亚大学的Marija Drndic小组发表了DNA通过石墨烯膜纳米孔的检测实验，该膜的厚度为1 - 5纳米，纳米孔的直径为5 - 10纳米。
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