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简介
这是sds page ppt，包括了SDS-PAGE简介，实验试剂与器材，实验步骤，注意事项，蛋白质在聚丙烯酰胺凝胶电泳时，它的迁移率取决于它所带净电荷以及分子大小和形状等因素等内容，欢迎点击下载。
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SDS-PAGE 杨兵 主要内容： 一、SDS-PAGE简介 二、实验试剂与器材 三、实验步骤 四、注意事项 一. SDS-PAGE（简介） SDS－聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE） ： 什么是聚丙烯酰胺凝胶？ 加入SDS的作用？ SDS-PAGE的用途？ SDS-PAGE分离蛋白质的原理？ SDS-PAGE的优缺点？ 垂直板电泳装置 1.聚丙烯酰胺凝胶 聚丙烯酰胺凝胶是由单体丙烯酰胺(Acr)和交联剂N，N-甲叉双丙烯酰胺(Bis)在加速剂N，N，N，N—四甲基乙二胺(TEMED)和催化剂过硫酸铵(AP)或核黄素的作用下聚合交联成三维网状结构的凝胶，以此凝胶为支持物的电泳称为聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)。 蛋白质在聚丙烯酰胺凝胶电泳时，它的迁移率取决于它所带净电荷以及分子大小和形状等因素。 当向蛋白质溶液中加入足够量SDS，由于十二烷基硫酸根带负电，使各种蛋白质—SDS复合物都带上相同密度的负电荷，它的量大大超过了蛋白质分子原有的电荷量， 因而掩盖了不同种蛋白质间原有的电荷差别，SDS与蛋白质结合后，还可引起构象改变，蛋白质—SDS复合物形成近似“雪茄烟”形的长椭圆棒，不同蛋白质的SDS复合物的短轴长度都一样，SDS消去了蛋白质电泳时的电荷和分子大小的因素，使蛋白质分子的电泳迁移率主要取决于它的分子量，而与所带电荷和形状无关。 3. SDS-PAGE的用途： 主要用于测定蛋白质分子量。 当分子量在15KD到200KD之间时，蛋白质的迁移率和分子量的对数呈线性关系，符合下式： logMW=K-bX 式中：MW为分子量，X为迁移率，k、b均为常数。 若将已知分子量的标准蛋白质的迁移率对分子量对数作图，可获得一条标准曲线，未知蛋白质在相同条件下进行电泳，根据它的电泳迁移率即可在标准曲线上求得分子量。 4. SDS-PAGE分离蛋白质的原理 分子筛效应：蛋白质分子在SDS-聚丙烯酰胺凝胶中电泳时电泳迁移率主要取决于它的分子量，分子量越小，迁移率越快。 凝胶由分离胶和浓缩胶组成： 上层为浓缩胶，凝胶孔径较大，没有分子筛效应，其pH为6.8，由于快慢离子所形成的高电压梯度，使得变性蛋白质分子在泳动中被压缩为很薄的一层，大大提高了分辨率。 下层为分离胶，凝胶孔径较小，有分子筛效应，pH为8.8，变性蛋白质分子所带负电荷基本一致，泳动速度主要决定于分子量。 5、SDS-PAGE优缺点 优点：设备简单、快速、分辨率和灵敏度高， 特别适用于寡聚蛋白及其亚基的分析鉴定和 分子量的测定 。 缺点：有许多蛋白质是由亚基或两条以上肽链组成的（如血红蛋白、胰凝乳蛋白酶等），他们在变性剂和强还原剂的作用下，解离成亚基或单条肽链。因此，对于这一类的蛋白质，SDS-PAGE测定的只是它们的亚基或单条肽链的分子量，而不是完整蛋白质的分子量。 二.实验试剂与器材 1.试剂： (1) 30%丙烯酰胺 (2) 10%SDS (3)分离胶缓冲液:3.0mol/L Tris-HCl pH 8.8 (4)浓缩胶缓冲液: 0.5mol/L Tris-HCl pH6.8 (5) 10%过硫酸铵(APS)溶液 (6) 四甲基乙二胺(TEMED) (7) 上样缓冲液:Tris-HCl、 SDS、溴酚蓝、甘油、 2-巯基乙醇 (8) 电极缓冲液（Tris-甘氨酸缓冲液） (9) 染色液:甲醇、水 、冰乙酸 、考马斯亮蓝R250 (10) 脱色液:甲醇、水 、冰乙酸 2.实验器材： 垂直板电泳装置 电泳仪 脱色摇床 移液枪 滤纸 大培养皿 垂直板电泳装置 三.实验步骤 1. 安装制胶模具。 2. 分离胶的制备与加入：按规定的比例制备分离胶；将分离胶充分混合后，小心倒入胶模中再在胶面上覆上一层水，水平静置至胶体凝固（室温不同，聚合时间不同）。 3. 倒出水并用滤纸把剩余的水分吸干。 4. 浓缩胶的制备与加入：按规定的比例制备浓缩胶；倒入混合好的浓缩胶，插入梳子（注意避免气泡产生），梳子底部与分离胶的前沿距离约1cm，水平放置直到胶体凝固。 分离胶配制 浓缩胶配制 5. 样品及标准品的准备：标准品按说明书进行处理，供试品 溶液的制备：按各品种项下规定制备。 6. 加样：待浓缩胶溶液聚合后小心拔出样品梳，将电极缓冲 液注满电泳槽前后槽，在供试品孔中加入供试品溶液和标准蛋白质溶液（加样量参照各品种项下规定）。 7. 电泳：垂直板电泳：恒压电泳，初始电压为80V，进入分离胶时调至150～200V，当溴酚蓝迁移至胶底处，停止电泳。 8.剥胶：电泳完成后，关闭电泳仪，拔出电极线。打开盖子，取出电泳模块，打开密封夹，取出玻璃板（凝胶）。将玻璃板取出置于水中，轻轻用撬胶板（绿色）撬开玻璃板，让凝胶滑入水中。 9.染色：用至少五倍体积染色液浸泡凝胶，于平缓摇摆平台上室温1h左右。 10.脱色：用水漂洗数次，再用脱色液脱色，至蛋白质条带 清晰。 四、注意事项 （1）安装电泳槽时要注意均匀用力防止夹坏玻璃板，避免缓冲液渗漏。 （2）虽然应用过硫酸铵／TEMED催化后灌胶15～20 min即可观察到凝胶的形成，但至少需40 min才能保证95％以上的单链聚合成长短以及具有合适的孔径大小。 （3）梳子需一次平稳拔出，否则会破坏加样槽的完整性。 （4）聚胶的最佳温度为23 ～ 25 ℃ ，需要注意灌胶前单体溶液(通常置于4℃冰箱)及玻璃板或管(有时从烘箱取出)也要平衡至此温度。 （5）剥胶时要小心，保持胶完好无损，染色要充分。 （6）聚丙烯酰胺具有神经毒性，操作时要戴手套。
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