截图
简介
这是质粒dna的提取ppt，包括了基本原理，操作步骤，注意事项，实验室安全，细菌质粒是一类双链、闭环的DNA，大小范围从1kb至200kb以上不等，操作步骤及注意事项，其它注意事项，PCR技术，基本原理，反应动力学，使用步骤及注意事项，反应参数要素，PCR优化等内容，欢迎点击下载。
质粒dna的提取ppt是由红软PPT免费下载网推荐的一款课件PPT类型的PowerPoint.
质粒DNA的提取和PCR技术 质粒提取 基本原理 操作步骤 注意事项 实验室安全 基本原理 细菌质粒是一类双链、闭环的DNA，大小范围从1kb至200kb以上不等。各种质粒都是存在于细胞质中、独立于细胞染色体之外的自主复制的遗传成份.质粒已成为目前最常用的基因克隆的载体分子，碱裂解法是最常用的方法。 基本原理为：当菌体在NaOH和SDS溶液中裂解时，蛋白质与线性DNA发生变性，质粒释放到上清中。当加入中和液后，因为闭环的质粒DNA分子虽然氢键破坏但双链并不分离。能够迅速复性，呈溶解状态，离心时留在上清中；蛋白质与染色体DNA变性相互缠绕成大分子复合物而呈絮状被SDS覆盖，当加入溶液三后形成PDS被离心时可沉淀下来。 试剂准备 ： 1. 溶液Ⅰ: 50mM葡萄糖 平衡渗透压，调节PH值，有利悬浮。 25mM Tris-HCl(pH 8.0) 调节PH值 10mM EDTA(pH 8.0）鏊和离子 抑制DNase活性 高压灭菌15min ，贮存于4℃ 2. 溶液Ⅱ：0.2N NaOH，1% SDS 裂解细菌，变性线性DNA 3. 溶液Ⅲ：醋酸钾（KAc）3M，pH 4.8 中和PH值，并与SDS作用沉淀 4.苯酚/氯仿/异戊醇（25：24：1）苯酚变性抽提蛋白，为tris-base平衡酚。氯仿防止苯酚与水互溶。异戊醇的作用是降低表面张力，可以减少泡沫 5.异丙醇，乙醇（无水乙醇、70%乙醇）沉淀质粒 6.TE：10mM Tris-HCl(pH 8.0)，1mM EDTA(pH 8.0)。 RNase A：10mg/ml 操作步骤及注意事项 1挑取单菌落，接种于含有相应抗生素的LB培养基中，于37℃振荡培养14～18 h。-培养时间不能太长，否则细菌老化，代谢产物太多。影响质粒质量。 2取1.5ml培养物入微量离心管中，室温离心12000g×1min，弃上清，将离心管倒置，使液体尽可能流尽。 3.将细菌沉淀重悬于100μl预冷的溶液Ⅰ中，剧烈振荡，使菌体分散混匀。 4.加200μl新鲜配制的溶液Ⅱ，颠倒数次混匀（不要剧烈振荡），并将离心管放置于冰上2-3min，使细胞膜裂解，DNA变性。-放置时间不能太长。因为在碱性条件下基因组DNA会慢慢断裂 。混匀动作要轻柔，既保证细菌沉淀在试剂中充分扩散又要避免机械剪切已变性的质粒DNA和染色体基因组DNA 。 5.加入150μl预冷的溶液Ⅲ，将管温和颠倒数次混匀，见白色絮状沉淀，冰上放置3-5min。-中和溶液，此时质粒DNA复性，染色体和蛋白质不可逆变性，形成不可溶复合物，同时K+使SDS-蛋白复合物沉淀。 6.12000g离心10min取上清，加入等体积的苯酚/氯仿/异戊醇，振荡混匀，4℃离心12000g10min。-抽提掉剩余蛋白。 7.小心移出上清于一新微量离心管中，加入0.5~0.7倍体积的异丙醇，混匀，4℃离心12000g，10min。-可以用两倍体积的无水乙醇，室温放置2-5min 离心。不要沉淀太久 8.1ml 75%乙醇洗涤沉淀1次，4℃离心，弃上清，将沉淀在室温下晾干。-不要太干，否则不易溶解。 9.沉淀溶于20μl TE（含RNase A 20μg/ml），37℃水浴30min以降解RNA分子，-20℃保存备用。 10.琼脂糖电泳检测。检测，定量。 其它注意事项： 1。质粒质量： 首先实验菌种生长的好坏直接影响质粒DNA的提取，因此对存放时间较长的菌种需要事先加以活化。其次操作过程注意：避免基因组断裂，除净蛋白，盐离子清洗干净。 质粒数量：同量摇菌量中质粒量取决于质粒拷贝数。低拷贝数质粒可以通过添加氯霉素来增大拷贝数。 2。阳性菌破壁裂解比较困难，可以先用溶菌酶处理。 溶液二中NaOH不要暴露在空气中太久。可能会与空气中的CO2 与NaOH作用，减弱了其碱性。 3。琼脂糖电泳进行鉴定质粒DNA时 如果能看到三条带，这三条带以电泳速度的快慢而排序，分别是超螺旋、开环和复制中间体（即没有复制完全的两个质粒连在了一起），注意碱法抽提得到质粒样品中应不含线性DNA ，另外如果发现运动得较慢的带，可能是由于操作不慎污染的大肠杆菌基因组DNA的片断。 实验室安全： 1。培养细菌的容器用过后都要及时进行灭菌，细菌培养基上清不要随便丢弃，应存放在一起进行灭菌处理，以免污染环境。 2。吸取苯酚时应注意安全。苯酚腐蚀性很强。吸取氯仿 异戊醇时要在通风橱中进行，氯仿 可引起神经系统功能紊乱要引起肝脏损害 。异戊醇其蒸气或雾对眼睛、皮肤、粘膜和呼吸道有刺激作用 3。电泳时注意避免EB污染。 PCR技术 基本原理 反应动力学 使用步骤及注意事项 反应参数要素 PCR优化 PCR技术 聚合酶链反应(Polymerase Chain Reaction ，PCR)是80年代中期发展起来的体外核酸扩增技术。 它具有特异、敏感、产率高、 快速、 简便、重复性好、易自动化等突出优点；能在一个试管内将所要研究的目的基因或某一DNA片段于数小时内扩增至十万乃至百万倍，使肉眼能直接观察和判断 。-可以用于基因克隆，目的基因检测等。 发展：Taq DNA聚合酶：分离于温泉菌中，耐高温。 PCR和TaqDNA聚合酶被美国《科学》杂志1989年的“年度分子”，并被列为80年代10项重大科学发明之首 基本原理： 类似于DNA的天然复制过程，其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。PCR由变性--退火--延伸三个基本反应步骤构成：①模板DNA的变性：模板DNA经加热至93℃左右一定时间后，使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准备；②模板DNA与引物的退火(复性)：模板DNA经加热变性成单链后，温度降至55℃左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合；③引物的延伸：DNA模板--引物结合物在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA 链互补的半保留复制链重复循环变性--退火--延伸三过程，就可获得更多的“半保留复制链”，而且这种新链又可成为下次循环的模板。每完成一个循环需2～4分钟， 2～3小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍。 PCR的反应动力学 ： PCR的三个反应步骤反复进行，使DNA扩增量呈指数上升。反应最终的DNA 扩增量可用Y＝(1＋X)n计算。平均扩增效率的理论值为100%，但在实际反应中平均效率达不到理论值。 反应曲线：反应初期，靶序列DNA片段的增加呈指数形式，随着PCR产物的逐渐积累，被扩增的DNA 片段不再呈指数增加，而进入线性增长期或静止期， 即出现“停滞效应” ，这种效应称平台期数（原因：PCR 扩增效率及DNA聚合酶PCR的种类和活性及非特异性产物的竟争等因素）。 操作步骤注意事项： 1。配置反应体系。 标准的PCR反应体系： 10×扩增缓冲液 1ul 4种dNTP混合物 200umol/L 引物 各1～10pmol 模板DNA 10～200ng Taq DNA聚合酶 0.25u Mg2+ 1.5mmol/L 加双或三蒸水至 10ul 2。 在加热至90℃以上的PCR仪中预变性94℃ 2分钟， 然后循环: 94℃ 1分钟， 50℃ 1分钟， 72℃ 1.5分钟，共30轮循环。 3. 循环结束后， 72℃ 10分钟，4℃保存。 4. 电泳结束，观察 注意问题： 1。防止核酸污染：PCR反应的最大特点是具有较大扩增能力与极高的灵敏性，但令人头痛的问题是易污染，极其微量的污染即可造成假阳性的产生。 吸样枪:吸样枪污染值得注意.由于操作时不慎将样品或模板核酸吸 入枪内或粘上枪头是一个严重的污染源。吸头、小离心管应一次性使用 。 开关盖时注意不要接触到内壁，并且不要开盖时间太长，以免污染。 2。预混和分装PCR试剂:PCR反应液应预先 配制好，然后小量分装。节省时间并保证各管成分平行 。最好在加样时都在冰上低温进行，以防止加入酶后反应立即开始。 3。阳性对照与阴性对照的设立。-重要！ 有利于问题的解决，对于优化条件以及排除污染可能性都很有用！ 反应参数要素： 1。PCR反应五要素 （1）Taq酶：酶量：催化一典型的PCR反应约需酶量2.5U(指总反应体积为100ul时)，浓度过高可引起非特异性扩增，浓度过低则合成产物量减少。保真性：rTaq-1~2kbp，LaTaq-~20kbp，Pfu（Pyrobest）-. 吸取时注意，保存在甘油中故比较粘稠。 （2）dNTP的质量与浓度 ：在PCR反应中，一般反应中每种dNTP的终浓度为20-200μmol/L 。4种dNTP的浓度要相等( 等摩尔配制)，如其中任何一种浓度不同于其它几种时(偏高或偏低)，就会引起错配。 （3）模板；模板可以是DNA片断，基因组，质粒，噬菌体，菌液等任何含DNA生物样品。可以是单链分子，也可以是双链分子，可以是线状分子，也可以是环状分子 一般反应中的模板数量为102 -105 拷贝。模板纯化程度影响扩增效率。 4）Mg2+浓度：Mg2+对PCR扩增的特异性和产量有显著的影响，在一般的PCR反应中，各种dNTP浓度为200umol/L时，Mg2+浓度为1.5～2.0mmol/L为宜。Mg2+浓度过高，反应特异性降低，出现非特异扩增，浓度过低会降低Taq DNA聚合酶的活性，使反应产物减少。 （5）引物：PCR 产物的特异性取决于引物与模板DNA互补的程度。最佳的引物浓度一般在0.1到0.5μM。以最低引物量产生所需要的结果为好，引物浓度偏高会引起错配和非特异性扩增，且可增加引物之间形成二聚体的机会。 引物设计的好坏是决定PCR成功与否最重要的因素。 引物设计原则： 1)引物长度约为18-30bp。 2)引物中G+C含量通常为40%-60%， G+C太少扩增效果不好，G+C过多易出现非特异条带。GC含量决定引物的解链温度 Tm＝4(G+C)+2(A+T). 3)四种碱基应随机分布，在3‘端不存在连续3个G或C，因这样易导致错配。 4）引物3'端最好与目的序列阅读框架中密码子第一或第二位核苷酸对应， 以减少由于密码子摆动产生的不配对。 5)在引物内， 尤其在3'端应不存在二级结构。 6)两引物之间尤其在3‘端不能互补， 以防出现引物二聚体， 减少产量。 7)引物5‘端对扩增特异性影响不大， 可在引物设计时加上限制酶位点，通常应在5'端限制酶位点外再加1-2个保护碱基。 8)引物不与模板结合位点以外的序列互补。所扩增产物本身无稳定的二级结构， 以免产生非特异性扩增，影响产量。 引物设计软件： Primer5.0， 6.0 2。PCR反应条件的选择：温度、时间和循环次数 温度与时间： 变性温度：一般93℃～94℃lmin足以使模板DNA变性 。太低解链不完全，太高影响酶活。 退火(复性)温度与时间 ：退火温度影响PCR特异性的。太高不能很好复性，太低会有非特异结合。提高退火温度可以提高特异性。退火温度与时间，取决于引物的长度、碱基组成及其浓度，还有靶基序列的长度。选择合适的温度 ：Tm值(解链温度)=4(G+C)＋2(A+T) 复性温度=Tm值-(5～10℃) 在此范围内进行优化。提高退火温度可以提高特异性。 复性时间一般为30～60sec 延伸温度与时间 ：一般选择在70～75℃之间，常用温度为72℃。延伸速度一般1kb/min。延伸进间过长会导致非特异性扩增带的出现。对低浓度模板的扩增，时间要稍长些。 循环次数：循环次数决定PCR扩增程度。PCR循环次数主要取决于模板DNA的浓度。一般的循环次数选在30～40次之间，循环次数越多，非特异性产物的量亦随之增多 PCR优化及特异性问题 1。没有扩增出目的条带： （1）引物设计合成有无问题。（2）模板:模板中含有杂蛋白质，含有Taq酶抑制剂。扩增的模板中GC含量高时或者含有重复序列时，使用GC Buffer。 （3）酶失活（4）退火温度太高 2。有目的条带，但是很弱 ： （1）调整Mg++浓度（2）降低退火温度---（可以考虑增加摸板量；.增加延伸时间；用产物做二次pcr 3.出现非特异性扩增(假阳性)原因： （1）引物与靶序列不完全互补、或引物聚合形成二聚体。（2）Mg2+离子浓度过高、退火温度过低，及PCR循环次数过多。 4。带扩增目的条带都带形模糊或者呈成片条带。 （1）引物浓度不适合或者退火温度不合适，可以改变浓度或者用梯度PCR，降落pcr摸索最佳条件。 （2）模板纯度不够，需重新纯化。 （3）酶量过多 5。阴性对照管中扩增出目的条带： 原因：器具如管子，枪头等有污染，或者与其他实验管交互污染。 几种PCR: 1.降落PCR:--特异性 通过在PCR的前几个循环使用严谨的退火条件提高特异性。循环设在比估算的Tm高大约5℃的退火温度下开始，然后每个循环降低1℃到2℃，直到退火温度低于Tm 5℃。这样，特异性最高的目的模板会被优先扩增，并在随后的循环中继续扩增占据优势。 2.巢式PCR:---特异性 nPCR首先用一对外引物进行第一轮PCR，然后再使用第一对引物扩增的DNA序列内部的一对引物再次扩散，所以称为巢式PCR。由于使用了两对引物并且进行了两轮扩增反应，因此试验的敏感性和特异性均增强。在一定情况下，这种方法对减少后扩增产物的污染问题极为有用.可以增加有限量靶序列的灵敏度，并且提高了困难PCR的特异性. 可以用于如稀有mRNA，5‘ RACE等. 3.反向P CR可用于扩增已知在核心区旁边的未知序列。 易错PCR;在PCR时引入错配，一般用于定向进化等。 重叠延伸PCR技术(gene splicing by overlap extension PCR，简称SOE PCR)由于采用具有互补末端的引物，使PCR产物形成了重叠链，从而在随后的扩增反应中通过重叠链的延伸，将不同来源的扩增片段重叠拼接起来.用于基因重组等。
展开
