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简介
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Western blot 实验技术 定义：印迹法（blotting）是指将样品转移到固相载体上，而后利用相应的探测反应来检测样品的一种方法。 1975年，Southern建立了将DNA转移到硝酸纤维素膜（NC膜）上，并利用DNA－RNA杂交检测特定的DNA片段的方法，称为Southern印迹法。而后人们用类似的方法，对RNA和蛋白质进行印迹分析，对RNA的印迹分析称为Northern印迹法，对单向电泳后的蛋白质分子的印迹分析称为Western印迹法，对双向电泳后蛋白质分子的印迹分析称为Eastern印迹法 Western Blot基本原理 在电场的作用下将电泳分离的多肽从凝胶转移至一种固相支持体，然后用这种多肽的特异抗体来检测。 Western Blot一般流程 SDS聚丙烯酰胺 凝胶电泳蛋白样品的制备裂解液 SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳原理： SDS 是一种离子性的界面活性剂，它有强离子性的硫酸根离子也带有疏水性的长碳链.当 SDS 与蛋白质混合时，它会以其碳链与蛋白质之疏水性胺基酸结合将蛋白质包起来，而以硫酸根离子外露与水分子作用.大多数蛋白质和 SDS 的平均结合量是 1:1.4 (以重量为单位)，而蛋白质结合固定比例之 SDS 後，由於 SDS 带强负价，使蛋白质原先的带电价微不足道，且每单位重量之蛋白质带电价一致 (charge density)，所以决定不同蛋白的泳动速率就只剩下分子大小一项因素 凝胶成份丙烯酰胺和N，N’-亚甲双丙烯酰胺 SDS 配胶的Tris缓冲液 TEMED 过硫酸铵(时间) Tris-甘氨酸电泳缓冲液 凝胶浓度与蛋白分离范围 半干法将凝胶和固相基质象三明治一样加在用缓冲液湿润滤纸之间。（小分子量蛋白） 湿法将凝胶和固相基质夹在滤纸中间，浸泡在转移装置的缓冲液中。（大分子量蛋白） 封闭脱脂奶粉（5％） BSA Western Blot 膜封闭液（生物试剂公司提供） 把硝酸纤维素滤膜放在密闭塑料袋或者培养皿中，根据滤膜面积以0.1ml/cm2的量加入加入一抗溶液与滤膜温育。37℃一小时，4 ℃过夜。倒掉一抗溶液，用TBST漂洗液滤膜3次，每次10min。加入用封闭液配制的二抗，摇床上缓慢摇动， 37℃一小时，4 ℃过夜。倒掉二抗溶液，用TBST漂洗液滤膜3次，每次10min。
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