截图
简介
这是环境分析化学(8)ppt，包括了高效毛细管电泳，高效毛细管电泳，弹性石英毛细管，高效毛细管电泳发展史等内容，欢迎点击下载。
环境分析化学(8)ppt是由红软PPT免费下载网推荐的一款化学课件PPT类型的PowerPoint.
第八章 高效分离分析技术
高效毛细管电泳
(High Performance Capillary Electrophoresis， HPCE )
毛细管电色谱
(Capillary Electro Chromatography， CEC）
多维色谱及色谱联用技术
(Multi-dimensional Chromatography， Hyphenated Techniques)
第八章（1）
高效毛细管电泳
(High Performance Capillary Electrophoresis， HPCE )
（一）概述
1. 高效毛细管电泳（HPCE）及其特点
高效毛细管电泳是溶质以电场为驱动力，
在 毛细管中按其淌度或分配系数不同进行高
效、快速分离的一种电泳新技术。它是以毛
细管为分离通道，以高压直流电场为驱动力
的 新型液相分离分析技术。
1. 弹性石英毛细管（25-75μm i.d.）
2. 缓冲溶液
3. 高压电场（10-30KV）
4. 柱上检测器
高效毛细管电泳的特点
2. 高效毛细管电泳发展史
毛细管电泳重要发展历程
文献：
1. Hjerten， S. Chromatogr. Rev. 1967， 9:122.
2. Virtanen， R. Acta Polytech Scand. 1974， 23:99.
3. Mikker， F. E. P. et al. J. Chromatogr. 1979， 169:11
4. Jorgenson， J. W， Lukacs K D， Anal. Chem. 1981， 53:1298.
5. Hjerten， S. J. Chromatogr. 1983， 270:1.
6. Hjerten， S. J. Chromatogr. 1985， 346:265.
7. Terabe， S. et al. Anal. Chem. 1984， 56:111.
8. Laner， H. H. Anal. Chem 1986， 58:166.
9. Gfrorer， P. Anal. Chem. News and Features 1998， 315A.
10. Puseckek， K. Anal. Chem. 1998， 70:3280
(二)高效毛细管电泳的基本理论
1. 基本概念
1）电泳、电泳淌度
电泳：是带电粒子在直流电场的作用下，于一定介质中所发生的定向运动，即带电粒子在电介质中，在电场作用下，以不同速度向电荷相反的电极方向移动，电泳的分离是以电场中溶质的迁移速度的差异为基础的。
离子的电泳淌度（μe）
离子在给定的缓冲溶液中，单位时间间隔和单位电场强度下移动的距离。（单位 cm2/v∙s）
电场强度（E）：是外加电压和毛细管长度 的 函数。(单:V/cm.)
溶质离子电泳淌度是该溶质的特征常数，不同溶质电泳淌度的不同，是电泳分离的内因。
1. 离子的淌度(绝对淌度）是指无限稀释溶液中离子在单位电场强度下的平均迁移速度。离子的淌度是由其受的电场力与其通过介质所受的摩擦力的平衡决定。
q : 离子电荷量 r : 离子半径
η ：溶液粘度
离子半径小，电荷多的离子具有高电泳淌度。
有效离子淌度（μef）：物质在实际溶液中的淌度，即指实验中测得的电泳淌度。它与离子形状、离子半径、溶剂化作用、介质的介电常数、溶剂粘度、离子的电荷数、离子的解离度、以及溶液酸度、温度等因素有关。
离子迁移速度（V）:
V= μe E
V: 迁移速度 ， μe: 电泳淌度 ， E : 电场强度
2）电渗现象、电渗流
（1）电渗现象：当固体与液体相接触时，如果固体表面因某种原因带一种电荷，则因静电引力使其周围液体带另一种电荷，在固液界面形成双电层，二者之间有电势差。当液体两端施加电压时，就会发生液体相对于固体表面的移动，这种液体相对于固体表面移动现象叫电渗现象。
(2)电渗流:电渗现象中液体的整体流动叫电渗流。
电渗流的产生
a) 石英表面带负荷
（Si-O）
b) 水合阳离子在
表面附近积聚
c) 电场作用下指向
负极的体相流动
电渗流是毛细管电泳中非常重要的物理现象，它以此控制溶质的迁移速度和方向，其大小直接影响分离效率和分析结果的精密度和准确度。
a.电渗流大小和方向
电渗流大小用速度或淌度表示：
VEOF =（εζ/η）E
或 μEOF =εζ/η
VEOF ：电渗速度 μEOF ：电泳淌度
ε：介电常数 ζ：Zeta电位
η：粘度 E ：电场强度
实际电泳分析中，VEOF 可以通过实验测定
Veo = Lef / teo
Lef : 毛细管有效长度
teo : 电渗流标记物（中性物质如硫脲）迁移时间
因为 Veo = VEOF
电渗流的方向取决于毛细管内壁表面电荷的性质。一般情下，石英毛细管内壁表面带负电荷，电渗流方向为由阳极到阴极。
b.电渗流的特性
（a）电渗流具有平流特性
（b）可使几乎所有物种（不论其电荷性质如 何）向同一方向运动。
c.电渗流作用
（1）电渗流在毛细管电泳中起到像HPLC
泵的作用，同时完成阴、阳离子分析。
（2）改变电渗流方向可以改变分离效率和
选择性。
（3）电渗流影响各物质迁移速度，控制
EOF在HPCE中极为重要。
d.电渗流的控制 影响电渗流的因素:
（a）pH值
电渗流正比毛细管内壁的ζ电势，对于相同材料毛细管，管中溶液pH值不同时，它们的表示电荷特性不同，毛细管ζ电势不同，电渗流的大小也不同。
（b）介质成分和浓度
（c）离子强度
介质离子强度影响双电层厚度，溶液粘
度和工作电流，因此影响 EOF大小。
（d）温度
影响溶液粘度，温度高，粘度低，EOF大。
（e）添加剂
为改善分离效率和选择性常常加入添加剂，
如：中性盐类、两性离子、表面活性剂、
有 机溶剂等。
2.基础理论
一种溶质从加电压开始迁移至检测器所需时
间称迁移时间，（也称保留时间）用 t 表示，
它等于迁移距离除以速度，公式表示为:
溶质的表观速度：Vap=μap·E （2）
离子型物质迁移时间为：
因此可以通过实验计算各种物质的表观淌度，有效淌度和电渗流
2）毛细管电泳柱效率
HPCE的柱效率用理论塔板数(N)表示，和一般
色谱一样，柱效率可以直接由电泳图求出。
3）分离度
毛细管电泳中的分离度和一般色谱一样，也用 Rs 表示，它是指表观淌度相近的两组分分开的程度，按色谱理论的Giddings方程，组分1，2的分离度等于两峰中心之间距离与两峰峰底平均值之比。
（三）分离模式
毛细管区带电泳（CZE）
毛细管区带电泳也称为毛细管自由溶液区带电泳，是毛细管电泳中最基本，最简单，也是应用最广的一种操作模式，毛细管内充入缓冲溶液，溶质以不同速率在分离的区带中进行迁移而被分离。由于电渗流（EOF）的存在，正负离子都可以用CZE分离，中性溶质本身在电场中不移动，随EOF一起流出毛细管。
在CZE中，操作的电压、温度都会影响柱效、分离度和分析时间，但最主要的操作参数是缓冲溶液的种类、浓度、pH值和缓冲溶液添加剂，可以改变CZE的分离选择性。
缓冲溶液的选择
选择原则：
（1）在所选的pH值范围内有较强的缓冲能力
（2）在检测波长下有低的紫外吸收
（3）小的淌度（即大体积，低电荷离子）降 低产生的电流
缓冲溶液的pH值
缓冲溶液的pH值强烈影响融熔硅毛细管柱内表面特征，即影响硅羟基的电离，从而影响电渗流变化，影响组分分离和选择性。
添加剂
添加剂是毛细管电泳中一个十分重要的控制因素。
添加剂的作用：
a.控制EOF大小与方向，达到增强分离选择性，缩短分析时间，提高分离度的目的。
b.抑制管壁吸附作用，提高分离效率和重现性，这对生物大分子分离尤为重要。
c.稳定溶质的三级结构，增加疏水溶质的溶解度。
d.扩大分离对象，加手性试剂可分离手性物质，加络合剂可分离中性分子。
e.增加溶液粘度，降低电流，优化分离条件。
表面活性剂是CZE中最常用的添加剂。多种类型：
阳离子型，阴离子型，两性离子型和非离子型。
表面活性剂不仅与溶质有作用，而且由于它吸附于毛
细管内壁上，可改变EOF的大小及方向。
1. 不加阳离子表面活性剂时，EOF 朝向阴极
2. 加阳离子表面活性剂时，由于电离生成的 阳离子基
团与管壁的 Si-O-基团之间的静电 作用，形成非极
性基团指向体相的垂直定向 排列，完全屏蔽了
Si-O-负电荷，Zeta 电势下降至零，抑制了EOF
3. 当表面活性剂浓度进一步增加时，疏水的非 极性链
之间互相作用，形成双分子层结构，产生正电荷表面
而导致EOF反向
CZE的应用：无机离子，有机酸， 在生物学领域特别是多肽，蛋白质，药物的分析。
在毛细管电泳缓冲溶液中加入表面活性剂，当其浓度超过临界胶束浓度（如SDS 为8-9 mM）时，单个的表面活性剂分子聚集而形成胶束。胶束是一个三维网状结构。
表面活性剂分子疏水性一端聚在一起朝向里，带电荷一端则朝向缓冲溶液，溶质基于在水相和胶束相间分配系数的不同而得到分离。
胶束电动色谱是电泳技术和色谱技术的交叉，它是唯一既能分离中性溶质又能分离带电组分的电泳技术。
中性物质分离过程及机理
胶束电动色谱分离条件的选择
a.表面活性剂种类：可分为阴离子型，阳离子
型，两性离子型和中性分子，但实际工作中
可选数量有限。
阴离子型：十二烷基磺酸钠（SDS)
阳离子型:十二烷基三（甲基）氯化铵
两性离子型：胆酰胺丙基二（甲基）氨基丙
磺酸
中性分子：辛基葡萄糖苷
b.表面活性剂浓度：容量因子与表面活性剂
浓度成线性关系，标准操作条件下表面活
性剂浓度为30-100mmol/L.浓度太低，胶束
稳定性差。
c.缓冲溶液pH值
d.有机溶剂及添加剂：加入甲醇，乙睛等有
机溶剂可提高选择性，改善分离度。
胶束电动色谱（MEKC）应用：
毛细管凝胶电泳（CGE)
毛细管凝胶电泳是以凝胶或聚合物网络为分离介质，基于被测组分的质荷比和分子体积不同而进行分离。
筛分介质选择
2. 线型聚合物(非胶筛分介质）
聚丙烯酰胺，羟烷基纤维素、聚乙烯
酰、葡聚糖。
CGE的应用：
毛细管等电聚焦( CIEF )
一种在毛细管内基于物质的等电点（pI）的不同而进行
分离的电泳技术。
毛细管等电聚焦的原理
两性物质以电中性状态存在时的pH值叫等电点，用pI表示。
当两性物质在毛细管中形成 pH 梯度时，不同等电点的溶质在外电场的作用下，分别向其等电点的pH值范围迁移，此过程叫聚焦。当溶质迁移到等于其等电点的pH值范围时，就不再移动，形成一个很窄的溶质带。
由于不同两性物质的等电点不同，聚焦的pH值范围不同，可以形成一个个溶质带而彼此分开。这是等电聚焦的基本原理。
毛细管等电聚焦的原理
毛细管等电聚焦的操作方法：
1.采用两性电解质混合液作为载体电解质，在毛细管内建立 pH 梯度（pH 3-9）
2.加电后，带电的两性离子和蛋白质在介 质中开始迁移，直到它们到达一个不带电的区域（pI处）此过程称之为聚焦。
3.通过调节两性电解质，可以使聚焦带移动
通过检测器而检测。
毛细管等电聚焦的应用
等电聚焦它不仅可以实现样品的浓缩，而且具
有高的分辨率，可以分离等电点差异小0.01pH
单位的相邻蛋白质，已成功地用于测定蛋白质
的pI值、蛋白质异构体的分离和其它方法难以
分离的蛋白质的分离分析。
毛细管等速电泳(CITP)
是一种“移动界面”电泳技术，在毛细管电泳达到平衡后，各区带相随移动，分成清淅界面，以等速移动。
在等速电泳中，使用两种缓冲体系：
a.前导电解质：淌度高于样品组分，充满整个毛细管柱。
b.尾随电解质，淌度低于样品组分，置于一端的电泳槽中。
被分离区带象夹心面包一样被夹在之间，以同速度运动实现分离。
毛细管等速电泳的特点和应用 毛细管等速电泳中各溶质带保持明显的界限，在每个区带中溶质的浓度保持恒定。可分离各种离子，用于样品的富集，浓缩。
（四）毛细管电泳仪
毛细管电泳是基于溶质在高电场下，在装有电泳介质的毛细管中的迁移速度不同而进行分离的技术。
仪器包括：进样、分离、检测和数据处理系统。
1.进样系统
进样体积 ：纳升（nl）
进样方式 ：
1）流体力学方式：
a. 进样端加气压
b.在毛细管出口端抽真空
c.利用虹吸现象
2）电动进样方式：
2.分离系统
由毛细管柱、毛细管柱恒温系统和高压电源三部分组成。
1) 毛细管柱：石英材料，外壁涂聚酰亚胺保护层。
内径： 25-75μm
外径： 350-400μm
有效长度： 80-100cm。
用前用酸、碱和有机溶剂清洗。
2) 恒温系统：精度±0.1℃
控温方法：气冷，液冷。
3) 高压电源：
电压：0-30KV 稳定性±0.1 %
电流：0-300μA
最常用恒压电源
3.检测系统
1）CE 对检测器的要求：
灵敏度高、分辨率高和响应时间短
2）CE 检测器的类型：
紫外、二极管阵列
激光诱导荧光
电化学
质谱 CE-MS
展开
