临床酶学检验技术介绍PPT

这是一个关于临床酶学检验技术介绍PPT，主要介绍了1.酶活性的国际单位定义。2.酶活性测定的连续监测法和定时法的概念。3.连续监测法的计算和方法设计。4.酶活性测定最适条件的概念和意义。5.ALT、AST、ALP、GGT、LD、CK测定参考方法原理和评价等等内容。酶的概念：人卫第六版 酶（enzyme）是由活细胞合成的、对其特异底物起高效催化作用的蛋白质，是机体内催化各种代谢反应最主要的生物催化剂(biocatalyst)。 人卫第七版 生物体内的酶（enzyme）是对其特异底物起高效催化作用的蛋白质和核糖核酸，前者是是机体内催化各种代谢反应最主要的催化剂。 酶促反应表示为： 底物：Subestrate：S 产物：Product：P 酶 ：Enzyme：E 酶的化学本质： 绝大多数的酶是蛋白质，称这类酶为enzyme 具有催化功能的RNA被称为核酶(ribozyme) 具有催化功能的DNA被称为脱氧核酶(deoxyribozyme) 酶的研究历史： 1926年J.B.Sumner首次从刀豆制备出脲酶结晶，证明其为蛋白质，并提出酶的本质就是蛋白质的观点 1982年T.Cech发现了第1个有催化活性的天然RNA——ribozyme（核酶），以后Altman和Pace等又陆续发现了真正的RNA催化剂 1995年，Jack W. Szostak 研究室首先报道了具有DNA连接酶活性的DNA片段，称之为脱氧核酶(deoxyribozyme) 临床酶学 高诊断灵敏度 高诊断特异性 临床酶学检验技术 酶活性测定 酶蛋白质量测定 临床酶学的历史： 1908年Wohlgemuth用尿淀粉酶（AMY）诊断急性胰腺炎 1930s，LPS、ALP、ACP开始用于临床——定时法 1950s，Karmen、La Due、Wroblewski等人建立了分光光度法，ALT、AST、CK、LD等酶活性测定应用于肝胆疾病、心脏疾病的诊断——连续监测法 1970s，同工酶和酶蛋白质量测定 1980s，同工酶亚型 酶的特性（一）化学本质：除核酶、脱氧核酶以外，为蛋白质（二）高效催化性（三）高度特异性（四）可调节性（五）不稳定性 绝对特异性(absolute specificity)：只能作用于特定结构的底物，进行一种专一的反应，生成一种特定结构的产物，欢迎点击下载临床酶学检验技术介绍PPT哦。

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酶的概念：人卫第六版 酶（enzyme）是由活细胞合成的、对其特异底物起高效催化作用的蛋白质，是机体内催化各种代谢反应最主要的生物催化剂(biocatalyst)。 人卫第七版 生物体内的酶（enzyme）是对其特异底物起高效催化作用的蛋白质和核糖核酸，前者是是机体内催化各种代谢反应最主要的催化剂。 酶促反应表示为： 底物：Subestrate：S 产物：Product：P 酶 ：Enzyme：E 酶的化学本质： 绝大多数的酶是蛋白质，称这类酶为enzyme 具有催化功能的RNA被称为核酶(ribozyme) 具有催化功能的DNA被称为脱氧核酶(deoxyribozyme) 酶的研究历史： 1926年J.B.Sumner首次从刀豆制备出脲酶结晶，证明其为蛋白质，并提出酶的本质就是蛋白质的观点 1982年T.Cech发现了第1个有催化活性的天然RNA——ribozyme（核酶），以后Altman和Pace等又陆续发现了真正的RNA催化剂 1995年，Jack W. Szostak 研究室首先报道了具有DNA连接酶活性的DNA片段，称之为脱氧核酶(deoxyribozyme) 临床酶学 高诊断灵敏度 高诊断特异性 临床酶学检验技术 酶活性测定 酶蛋白质量测定 临床酶学的历史： 1908年Wohlgemuth用尿淀粉酶（AMY）诊断急性胰腺炎 1930s，LPS、ALP、ACP开始用于临床——定时法 1950s，Karmen、La Due、Wroblewski等人建立了分光光度法，ALT、AST、CK、LD等酶活性测定应用于肝胆疾病、心脏疾病的诊断——连续监测法 1970s， 同工酶和酶蛋白质量测定 1980s，同工酶亚型 酶的特性（一）化学本质：除核酶、脱氧核酶以外，为蛋白质（二）高效催化性（三）高度特异性（四）可调节性（五）不稳定性 绝对特异性(absolute specificity)：只能作用于特定结构的底物，进行一种专一的反应，生成一种特定结构的产物 。 相对特异性(relative specificity)：作用于一类化合物或一种化学键。立体结构特异性(stereo specificity)：作用于立体异构体中的一种。 （一）米氏方程（二）酶促反应进程（三）动力学参数（四）酶偶联反应 （一）米氏方程 1913年，德国化学家Michaelis和Menten根据中间产物学说对酶促反映的动力学进行研究，推导出了表示整个反应中底物浓度和反应速度关系的著名公式，称为米氏方程。 （二）酶促反应进程 1.延滞期 是指酶促反应开始至达到最大反应速度所需要的时间 2.线性期 是指酶促反应速度保持恒定的时期，不受底物浓度的影响 3.非线性期 随着反应时间的延长，底物消耗越来越明显，酶促反应速度明显下降，偏离线性而进入非线性期 　　　　　　酶促反应进程好似100m径赛 （三）动力学参数 1.初速度(initial velocity)指在反应最初阶段底物的消耗量很小（一般在5﹪以内）时的反应速度，用v0来表示 2.最大反应速度(maximum velocity)指当酶的结合位点与底物结合饱和时的反应速度，通常用V或Vmax来表示 3.米氏常数（Michaelis constant，Km）指酶促反应速度为最大反应速度一半时的底物浓度，单位同底物浓度 （四）酶偶联反应 Ex：待测酶 Ea：辅助酶 Ei：指示酶 　　　酶偶联反应进程 1.预孵育期 2.延滞期 3.线性期 4.非线性期 （一）按血清酶的来源分 1.血浆固有酶 2.非血浆固有酶 ①外分泌酶 ②细胞酶 注：除凝血酶和纤溶酶外，血清酶与血浆酶基本一致 （二）按诊断特异性分 ①非器官特异酶 ②器官特异酶 　　（三）血清酶的去路 　1.肾小球滤过从尿液中排出 　2.网状内皮系统清除 　3.血管内失活或灭活 1.性别 2.年龄 3.饮食 4.运动 5.妊娠 1.酶合成异常 2.细胞内酶的渗漏 3.酶进入血液的方式 4.其他 （一） 酶活性单位 1.惯用单位 2.国际单位：在特定条件下，1分钟能转化1微摩尔底物（µmol/ min）的酶量为一个“国际单位” 3.Katal单位：即每秒钟转化1个摩尔底物（mol /s）的酶量 （二） 酶活性浓度 指单位体积样品中的酶活性单位， 习惯用U/L来表示体液中酶活性即酶活性浓度（三）正常上限升高倍数（upper limits of normal， ULN)：是指用测得的酶活性结果除以参考范围上限 　　以mg/Ｌ或µg/Ｌ来表示优点： ①灵敏度高 ②特异性高 ③可测定无活性的酶 ④与酶活性测定一起，计算免疫比活性， 可能提供新的资料和信息 ⑤在同工酶测定中更有价值 （一）概念 　　　将酶与底物在特定条件（缓冲液、温度等）下孵育，经过一定时间后，用终止液终止反应，通过化学或生物化学的方法测出底物或产物的总变化量，除以时间即可计算出底物消耗速度（－d[S]/min）或产物生成速度（d[P]/min），将速度换算为µmol/ min便是以国际单位表示的酶活性。 （二）计算 （一）概念 　　　将酶与底物在特定条件（缓冲液、温度等）下孵育，每隔一定时间（2s∼60s）连续测定酶促反应过程中某一底物或产物的特征信号的变化，从而计算出每分钟的信号变化速率。 最适条件（optimum condition）的概念：　　　是指能满足酶发挥最大催化效率所需的条件。 1.合适的底物和最适底物浓度 2.理想的缓冲液种类和最适离子强度；反应液的最适pH 3.最适反应温度 4.合适的辅因子、激活剂浓度；酶偶联反应还需要确定指示酶和辅助酶的用量 5.合理的测定时间，延滞期应尽量短暂并有足够的线性期 6.合适的样品与反应试剂的比例；足够的检测范围 7.尽量去除各种抑制剂 底物选择的原则是： ①选择Km最小的底物 ②要有足够的溶解度 ③酶对底物特异性高 ④底物稳定性好 ⑤较高临床价值的底物 底物浓度的确定： ①单底物酶促反应：选择[S]＝10Km～20Km，此时反应速度达到最大反应速度90.9% ～ 95.2% ②双底物酶促反应：[A]/[B]之间的关系是一条双曲线，有无数组数据。采取最经济原则。F（一般选90%或95%） 缓冲液种类的选择原则： ①尽量使用活性缓冲液 ② pKa与测定pH比较接近，有足够的缓冲容量 ③纯度高，不含有抑制酶活性的杂质 ④温度依数性小 ⑤对酶有稳定作用 缓冲液离子强度的确定：离子强度越高，电解质干扰酶和底物结合，酶活性将逐步下降，能满足缓冲容量的要求即可。 ①大多数酶活性测定的离子强度在0.1mmol/L左右 ② ALP用AMP缓冲液，离子强度达到0.9mmol/L，有磷酸基团接受体作用 ③GGT用高浓度的双甘肽有酰基接受体作用 常用的缓冲液： N-2-羟乙基哌嗪-N’-2-乙磺酸（HEPES） N，N’-双（2-乙磺酸）哌嗪（PIPES）三羟甲基氨基甲烷（Tris）二乙醇胺（DEA）三乙醇胺（TRA） 2-甲基-2-氨基-1丙醇（AMP） 在1986年以前IFCC推荐酶活性测定的温度是30℃ 2002年IFCC正式发表了“37℃下检测酶催化活性浓度的IFCC一级参考方法操作手册和参考制品认可系统” 目前基本无异议，确定37℃为酶活性测定温度 ①脱辅基酶的酶活性恢复——预孵育期 ② EDTA——络合重金属离子 ③巯基酶需巯基试剂做激活剂　　反复实验法确定用量 ①延滞期的确定原则是多观察几例浓度不等、病理情况不同的标本，选择延滞期最长者作为确定值。 ②线性期的确定 线性期的确定与酶浓度的可测上限与非线性度有关。 ③计算非线性度，按最小二乘法的计算要求，读数次数应不少于4次，读数间隔按一般仪器要求30 s就足够了，线性期在2min以上即可。 　样品量与反应液总量的比例与方法检测的灵敏度和检测上限有关，与测定误差也有关 ①样品/试剂越大可测上限越小，灵敏度越高，K值越小。1：10 ～1：100之间，1：30左右比较合适（CHE为特例，1：601 ） ②改变样品/试剂是改变K值最简单的方法， K值一般确定在2000 ～ 5000之间 ③可测上限的确定与临床样品的分布和临床意义有关，有些仪器具有线性扩展功能 ①最常见的抑制剂有产物的抑制、底物的抑制，分析器材或试剂中的重金属及体液中的药物等造成的抑制。 ②采取的措施：选用高纯度的原料、高纯净水、器材干净，在反应液中加入金属螯合剂，甚至可以引入一个副反应来去除产物的抑制作用等。 （一）仪器 　　　待测物的摩尔吸光系数与仪器波长的准确性、带宽、比色杯透光性有关。K值的设置还需考虑稀释体积、比色杯的光径、副波长等因素影响（二）校准物（三）实验参数 （四）副反应的干扰 同一种属中由不同基因或等位基因编码的多肽链单体、纯聚体或杂化体，具有相同的催化作用，但其分子构成、空间构像、理化性质、生物学性质以及器官分布或细胞内定位不同的一组酶称为同工酶（isoezyme）凡酶蛋白结构不同的同工酶称为原级同工酶，而将经加工或修饰后的同工酶称为次级同工酶或酶多种形式 某些同工酶从组织进入体液后在蛋白酶作用下降解成不同的亚型（isoform） 原理：　　　由于各型同工酶的一级结构或空间构象不同，形状也不同，因而带电性质不同，在电场中的电泳迁移率不同，使各型同工酶分离，然后用酶催化性质选择合适的显色系统使区带呈色评价：　　　优点是选择合适的电泳条件可获得同工酶谱的全貌但缺点是其显色系统不可能是所有同工酶的最适条件，而且定量也比较困难只是一种半定量的方法　　　酶与体内的白蛋白、免疫球蛋白等复合物形成“矫作物” 常用的显色系统有： ①重氮试剂染料：ALP、GGT同工酶的测定 ②电子传递染料：脱氢酶反应或脱氢酶偶联的指示反应产生NAD（P）H，其中H+ 经酚嗪甲酯硫酸盐（PMS）传递，交给四氮唑盐生成不溶性有色的甲臜（formazan，音zā）化合物。LDH同工酶的测定 原理：　　　免疫抑制法原理是利用某一亚基的特异性抗体与同工酶中对应的亚基特异结合而抑制其活性；化学抑制法是利用一定浓度某些化学试剂选择性抑制某类同工酶；分别测定抑制前后的酶活性，间接计算出各类同工酶的活性。评价：　　　免疫抑制法优点是抑制特异性高；缺点是需要制备抗体，测定成本高。化学抑制法往往存在待测同工酶同时被抑制或其他同工酶抑制不彻底的缺点。 原理：　　　利用各型同工酶对热的稳定性差异的原理来测定同工酶。如碱性磷酸酶同工酶分为四型：肠型、生殖细胞型、胎盘型和非特异组织型。非特异组织型是在酶蛋白合成后，经过不同形式的修饰和加工，形成的肝型、胆型、肾型、骨骼型等酶的多种形式。　　　各型对热稳定性：胎盘型>小肠型>其他型。若经65℃15min的样品预处理后只留下胎盘型同工酶。评价：　　　因特异性较差而较少使用。 原理：　　　利用糖链亲和剂凝集素如麦胚凝集素（WGA）、刀豆凝集素（ConA）等与同工酶结合率的不同，对某型同工酶加以分离后进行测定。　　　ALP骨型同工酶与WGA有较高的亲和力，结合后形成沉淀，总酶活性减去上清液中未结合部分的酶活性就是骨型同工酶的活性。评价：　　　因特异性较差而较少使用。 1.测定谷氨酸 以酶电极法作代表，因需特殊仪器不适合临床检验 2.测定丙酮酸 ①以赖氏法为代表的定时法 ②以IFCC推荐法为代表的连续监测法 ③偶联丙酮酸氧化酶法 1. α-酮戊二酸的用量 2.内源性丙酮酸和GLDH的干扰 3.添加5’-磷酸砒哆醛 4.两个指示酶 5.预孵育期长 比色法连续监测法荧光法化学发光法 1.缓冲液和pH 2.巯基激活物 3.腺苷酸激酶的干扰和消除 4.EDTA的作用 5.样品保存 1.以布氏（Bodansky）法为代表：β-甘油磷酸钠做底物 2.以金-阿（King-Armstrong）法为代表：磷酸苯二钠做底物 3.以皮-劳（Bessey-Lowery-Brock）法为代表：人工合成底物：磷酸对硝基酚二钠盐（PNPP） 1. AMP缓冲液 2.底物有一定自身水解作用 1. L-γ-谷氨酰-α（β）-萘胺做底物，催化生成的α（β）-萘胺与重氮试剂生成红色化合物。 2. γ-L-谷氨酰对硝基苯胺（GNA）做底物，催化生成的对硝基苯胺在碱性环境下呈黄色，可以连续监测。 3. 3-羧基-γ-L-谷氨酰对硝基苯胺（GCNA）做底物，催化生成的2-硝基-5-氨基苯甲酸在碱性环境下呈黄色，可以连续监测。 1. 若反应温度37℃时最适pH则为7.70 2. 5-氨基-2-硝基苯甲酸在410nm的摩尔消光系数为7.96 ×103（pH为7.70） 3. 样品体积分数0.0909 1.一类方法是利用正向反应（L→P），以乳酸为底物，测定反应中NAD+的还原速率。分为定时法和连续监测法 2.另一类方法是利用逆向反应（P→L），以丙酮酸为底物，测定反应中NADH的氧化速率。为连续监测法 1. 37℃时最适pH为9.4，使用Tris缓冲液显然不合适，而改用N-甲基-D-葡糖胺做缓冲液 2. 在各类乳酸盐中，乳酸锂首选。关于NAD+应选择游离酸型与锂盐的混合型（游离酸：锂盐=1：5） 3. LD4和LD5对冷不稳定，故样品不宜冰箱存放 4. M和H亚基的理化性质相差悬殊，很难兼顾 1.一类是以天然淀粉为底物的测定方法：水解前后粘度或浊度；测产物葡萄糖；淀粉与某些活性染料呈色的；碘遇直链淀粉呈兰色碘淀粉比色法曾一度作为临床最常用的方法 2.另一类方法是以人工合成的麦芽寡糖苷为底物的测定方法，与天然底物相比，最突出的优点是底物的结构和分子量确定 1. HEPES缓冲系统随着pH升高PNP的摩尔消光系数会加大 2. α-葡萄糖苷酶对底物有缓慢的水解作用 3.多功能α-葡萄糖苷酶 1.一类是以乙酰胆碱酯做底物，常用的底物有氯化乙酰胆碱、碘化乙酰胆碱，生成产物乙酸造成pH下降，然后通过以下方法测定①pH差示法 ②pH指示剂法 ③羟胺比色法 2.第二类是以碘化乙酰硫代胆碱做底物，测定方法有①产物硫代胆碱与5-巯代-2-硝基苯甲酸（DTNB）生成黄色产物5-硫代硝基苯甲酸（5-TNBA），可以连续监测吸光度的变化②硫代胆碱使黄色的高铁氰化钾还原为无色，连续监测405nm的吸光度下降速度来计算出胆碱酯酶的活性 1.一类是以天然淀粉为底物的测定方法：水解前后粘度或浊度；测产物葡萄糖；淀粉与某些活性染料呈色的；碘遇直链淀粉呈兰色碘淀粉比色法曾一度作为临床最常用的方法 2.另一类方法是以人工合成的麦芽寡糖苷为底物的测定方法，与天然底物相比，最突出的优点是底物的结构和分子量确定 1. CHE是血清固有酶，酶含量高，若反应速率超过酶反应线性范围需将样品稀释后测定。 2.从酶动力学进程分析，采用双试剂，试剂1中的DTNB先与血清孵育可以消除干扰物，再用底物启动酶促反应可以得到较好的线性期。 1. 根据酶是蛋白质和生物催化剂这两大特性，酶浓度的定量可以分别用酶蛋白质量或酶催化活性来表示。酶催化活性测定方法简便、快速、经济，是酶浓度的定量的主要手段。 2. 酶催化活性是用酶促反应的反应速度来表示，检测速度的方法分为定时法和连续监测法，目前连续监测法已经逐步取代了定时法。 3. 连续监测法按原理来分可分为色素原底物、脱氢酶指示系统、氧化酶指示系统等。 4. 酶催化活性是一种酶浓度相对定量的方法，与测定方法、测定条件、原料来源、仪器状态、分析参数、校正品等多种因素有关，各实验室应按最适条件的原则选择方法和使用，力求检测结果具有可比性。 5. 至今IFCC已建立ALT、AST、CK、LD、GGT、ALP测定的参考方法和参考物质，也有AMY、CHE、LPS测定的推荐方法。 6. 酶活性参考物质不是标准品，必须与测定系统其他要素一起使用才有价值。 1. 酶活性测定的溯源性要求尤其重要，酶活性测定标准化工作任重而道远。 2. 自动生化分析仪的发展与方法学的发展是相辅相成的，若有荧光检测器能自动连续监测，也许会有新的诊断酶用于临床，也必将使方法学得到进一步发展。 3. 随着免疫学技术的发展，越来越多的同工酶及其亚型用于临床，这仍然是诊断酶学发展的方向。酶试剂分析、工具酶、抗体酶、固相酶等其他领域的研究将使酶学驶向快速发展之路。DrR红软基地